一種具有免疫活性的多肽衍生物及其內(nèi)參抗體的制備方法和應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種具有免疫活性的多肽衍生物及其內(nèi)參抗體的制備方法和應(yīng)用，所述多肽衍生物具有下列序列結(jié)構(gòu)：R8(Kys)4-(Lys)2-Lys-Gly，其中，R表示多肽片段，其序列為：YDESGPSIVHRKCF-GSK。根據(jù)本發(fā)明專利技術(shù)實(shí)施例的具有免疫活性的多肽衍生物，一個(gè)賴氨酸支架上同時(shí)合成八個(gè)目的多肽，該目的多肽大大的增加了多肽抗原的分子量及抗原性，從而免去偶聯(lián)載體蛋白，使抗原的特異性更好。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及化學(xué)合成
，更具體地，本專利技術(shù)涉及一種具有免疫活性的多肽衍生物及其內(nèi)參抗體的制備方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
目前，常用的多肽化合物沒(méi)有完整的免疫原性，免疫時(shí)需要偶聯(lián)載體蛋白，并且特異性不強(qiáng)，靈敏度不高，制備方法復(fù)雜。更重要的是由于制備后的抗原含有載體蛋白，所以用此抗原制備的抗體會(huì)產(chǎn)生抗載體蛋白的抗體，有時(shí)會(huì)對(duì)后期的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生不良影響即非特異性反應(yīng)。·
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)旨在至少解決上述技術(shù)問(wèn)題之一。為此，本專利技術(shù)的一個(gè)目的在于提出一種具有完整免疫原性，且制備方法簡(jiǎn)單的具有免疫活性的多肽衍生物。根據(jù)本專利技術(shù)實(shí)施例的具有免疫活性的多肽衍生物，具有下列序列結(jié)構(gòu)R8 (Kys) 4- (Lys) 2-LyS_Gly，其中，R 表示多肽片段，其序列為YDESGPSIVHRKCF_GSK。根據(jù)本專利技術(shù)實(shí)施例的具有免疫活性的多肽衍生物，一個(gè)賴氨酸支架上同時(shí)合成八個(gè)目的多肽，該目的多肽大大的增加了多肽抗原的分子量及抗原性，從而免去偶聯(lián)載體蛋白，使抗原的特異性更好。本專利技術(shù)的另一個(gè)目的在于提出一種具有免疫活性的多肽衍生物及其內(nèi)參抗體的制備方法，其具體操作步驟可以包括a)提供9-芴基甲氧羰酰基保護(hù)的氨基酸(Fmoc-AA)并使其活化，得到活化氨基酸；b)將所述活化氨基酸與P-羥甲基苯氧甲基多聚乙烯樹脂(HMP樹脂)反應(yīng)，得到連接有氣基酸的樹脂；C)脫除所述連接有氨基酸的樹脂的Fmoc保護(hù)基；d)將脫除Fmoc保護(hù)基的連接有氨基酸的樹脂與過(guò)量的活化羧基組份偶聯(lián)，并脫去偶聯(lián)后活化氨基組份的氨基保護(hù)基；e)重復(fù)步驟d)至脫去偶聯(lián)后活化氨基組份的氨基保護(hù)基的數(shù)目為8，得到八分支活化氨基組份骨架；f)將所述八分支活化氨基組份骨架同時(shí)連接8個(gè)相同的多肽，得到肽樹脂，將所述肽樹脂分離提純，得到具有免疫活性的多肽衍生物。根據(jù)本專利技術(shù)實(shí)施例的具有免疫活性的多肽衍生物及其內(nèi)參抗體的制備方法，其合成過(guò)程在自動(dòng)化的多肽合成儀上完成，制備工藝簡(jiǎn)便，結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確，偶聯(lián)率高，周期短，自動(dòng)化程度高。為了快速得到八分支活化氨基組份骨架，所述活化氨基組份優(yōu)選為賴氨酸。當(dāng)所述活化氨基組份為賴氨酸時(shí)，在脫去偶聯(lián)后活化氨基組份的氨基保護(hù)基過(guò)程中便可脫去兩個(gè)氨基保護(hù)基，再與過(guò)量的賴氨酸偶聯(lián)時(shí)，就可以與兩個(gè)賴氨酸同時(shí)偶聯(lián)，再脫去偶聯(lián)后活化氨基組份的氨基保護(hù)基時(shí)便可脫去四個(gè)氨基保護(hù)基。依此類推，第三次脫除過(guò)程便可脫去八個(gè)氨基保護(hù)基，得到八分支活化氨基組份骨架。所述八個(gè)相同的多肽R優(yōu)選為YDESGPSIVHRKCF-GSK，由此，便可得到具有免疫活性的多肽衍生物(YDESGPSIVHRKCF-GSK) 8 (Kys) 4- (Lys) 2-Lys_Gly。關(guān)于具有免疫活性的多肽衍生物的分離提純，具體可以包括f-Ι)用三氟乙酸(TFA)結(jié)合清除劑與所述肽樹脂反應(yīng)，以將所述具有免疫活性的多肽衍生物從肽樹脂上分離； f-2)反應(yīng)后去除清除劑，并用萃取液萃取，得到具有免疫活性的多肽衍生物粗品;f-3)將具有免疫活性的多肽衍生物粗品進(jìn)行純化，得到具有免疫活性的多肽衍生物。關(guān)于清除劑的選擇，沒(méi)有特殊限制，只要能將所述具有免疫活性的多肽衍生物從肽樹脂上分離即可，優(yōu)選地，所述清除劑為1，2-乙二硫醇(EDT)、硫代苯甲醚和水的混合溶液。為了保證反應(yīng)的充分進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選3h。所述萃取液的選擇也沒(méi)有特殊限制，考慮到成本問(wèn)題，所述萃取液優(yōu)選為乙醚。關(guān)于具有免疫活性的多肽衍生物的純化，采用高效液相色譜分離純化，其具體操作條件為 色譜柱 Ci8 25 X 250mm 色譜儀 Waters 600美國(guó)Waters公司流動(dòng)相 A-Ο. P/oTFA (三氟乙酸)H2O B -O. 1% TFA (三氟乙酸)于60 乙腈 檢測(cè)波長(zhǎng) 214nm 流速 I Oml/分鐘 洗脫梯度 2G-60%B 洗脫時(shí)間 30分鐘由此，可制得純度為98%以上的具有免疫活性的多肽衍生物。本專利技術(shù)還提出了一種具有免疫活性的多肽衍生物在制備抗體中的應(yīng)用。基于所述具有免疫活性的多肽衍生物具有完整的免疫原性，則根據(jù)該具有免疫活性的多肽衍生物制備而成的抗體具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，為廣大科研人員提供了高質(zhì)量的抗體，同時(shí)為開發(fā)其它多肽抗體開辟了一條新思路。本專利技術(shù)的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過(guò)本專利技術(shù)的實(shí)踐了解到。附圖說(shuō)明本專利技術(shù)的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中圖1是根據(jù)本專利技術(shù)實(shí)施例的具有免疫活性的多肽衍生物高效液相色譜分析示意圖。具體實(shí)施例方式以下通過(guò)具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本專利技術(shù)，下列實(shí)施例用于說(shuō)明目的，而非用于限制本專利技術(shù)的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，可按照常見的分子克隆手冊(cè)所述的條件進(jìn)行操作。下列實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買所得。實(shí)施例1具有免疫活性的多肽衍生物的制備 一、試驗(yàn)材料HMP resin (P-輕甲基苯氧甲基多聚乙烯樹脂，Wang樹脂)購(gòu)于Merck公司Fmoc-AA(9-芴基甲氧羰酰基保護(hù)的氨基酸)購(gòu)于Merck公司NMP氮甲基吡咯烷酮購(gòu)于Merck公司DCM 二氯甲烷購(gòu)于Merck公司MeOH甲醇購(gòu)于Merck公司Piperidine 哌唳購(gòu)于 Merck 公司DMAP 二甲基氨基吡啶購(gòu)于Sigma公司HOBT羥基苯并三唑購(gòu)于Sigma公司DCC 二環(huán)已基碳二亞胺購(gòu)于Sigma公司TFA三氟乙酸購(gòu)于Sigma公司EDT 1,2-乙二硫醇購(gòu)于Sigma公司硫代苯甲醚購(gòu)于Sigma公司結(jié)晶苯酚購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司公司乙腈購(gòu)于Merck公司二、試驗(yàn)儀器多肽自動(dòng)合成儀美國(guó)CSBio 336型多通道多肽自動(dòng)合成儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀日本YAMATO CE50型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀高效液相色譜儀Waters 600E型冷凍干燥機(jī)美國(guó)Virtis真空循環(huán)水泵鄭州長(zhǎng)城科貿(mào)公司SH-B型離心機(jī)美國(guó)SIGMA公司三、試驗(yàn)步驟1、活化 Fmoc-AA。所述Fmoc-AA的結(jié)構(gòu)式如下所示權(quán)利要求1.一種具有免疫活性的多肽衍生物，所述多肽衍生物具有下列序列結(jié)構(gòu)R8 (Kys) 4- (Lys) 2-LyS_Gly，其中，R 表示多肽片段，其序列為YDESGPSIVHRKCF_GSK。2.一種具有免疫活性的多肽衍生物及其內(nèi)參抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟a)提供9-芴基甲氧羰酰基保護(hù)的氨基酸(Fmoc-AA)并使其活化，得到活化氨基酸；b)將所述活化氨基酸與P-羥甲基苯氧甲基多聚乙烯樹脂(HMP樹脂)反應(yīng)，得到連接有氣基酸的樹脂；c)脫除所述連接有氨基酸的樹脂的Fmoc保護(hù)基；d)將脫除Fmoc保護(hù)基的連接有氨基酸的樹脂與過(guò)量的活化羧基組份偶聯(lián)，并脫去偶聯(lián)后活化氨基組份的氨基保護(hù)基；e)重復(fù)步驟d)至脫去偶聯(lián)后活化氨基組份的氨基保護(hù)基的數(shù)目為8，得到八分支活化氨基組份骨架；f)將所述八分支活化氨基組份骨架同時(shí)連接8個(gè)相同的多肽，得到肽樹脂，將所述肽樹脂分離提純，得到具有免疫活性的多肽衍生物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有免疫活性的多肽衍生物及其內(nèi)參抗體的制備方法，其特征在于，在步驟a)中，所述Fmoc-AA通過(guò)與人多巴胺脫羧酶(DDC)和羥基苯并三唑(HOBT)反應(yīng)本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種具有免疫活性的多肽衍生物，所述多肽衍生物具有下列序列結(jié)構(gòu)：R8(Kys)4?(Lys)2?Lys?Gly，其中，R表示多肽片段，其序列為：YDESGPSIVHRKCF?GSK。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：姬志娟，鄔曉樂(lè)，鄔江，張波，張軍龍，張春玲，張婉婷，薛金蓮，沈向陽(yáng)，喬國(guó)明，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：北京博奧森生物技術(shù)有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：