本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)提供一株重組大腸桿菌及用該菌株制備磷脂酶A1的方法。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)成功構(gòu)建了一株磷脂酶A1基因來(lái)源于液化沙雷氏菌CICC?No.21538的基因重組大腸桿菌BL21（DE3）/pET-pla?CCTCC?M?2012423，用該菌株進(jìn)行液體發(fā)酵來(lái)制備溶血性磷脂酶A1，其制備方法包括斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、自發(fā)誘導(dǎo)培養(yǎng)（包括添加滲透性物質(zhì)）以及粗酶液的提取。利用本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)菌株通過(guò)液體發(fā)酵制備磷脂酶A1，具有產(chǎn)酶量和酶活性高、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)周期短、成本低、易于工藝放大等優(yōu)點(diǎn)，在油脂精煉、磷脂改性等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)屬于基因工程和微生物發(fā)酵
，具體涉及一株重組大腸桿菌及用該菌株進(jìn)行自誘導(dǎo)發(fā)酵來(lái)制備磷脂酶A1的方法。
技術(shù)介紹
磷脂酶A1 (PhospholipaseA1, EC 3.1.1.32,簡(jiǎn)稱(chēng)PLA1)屬于水解酶,可專(zhuān)一水解天然磷脂Sn-1位酰基，得到Sn-2酰基溶血磷脂和游離脂肪酸。磷脂酶A1是一種優(yōu)良的表面活性劑，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料和皮革等領(lǐng)域；此外，磷脂酶4還可應(yīng)用于植物油脫膠，同傳統(tǒng)脫膠方法相比，磷脂酶A1脫膠這種新型脫膠方法具有反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少、節(jié)能環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)已在油脂精煉行業(yè)得到大規(guī)模推廣。經(jīng)證實(shí)，許多動(dòng)物的細(xì)胞、組織和毒液含有少量的磷脂酶4。磷脂酶A1的傳統(tǒng)來(lái)源為動(dòng)物胰液，但該來(lái)源提取量有限且價(jià)格昂貴，已于近幾年逐漸被淘汰，取而代之的是從微生物中提取，但提取自微生物的磷脂酶A1大多與細(xì)胞膜結(jié)合，難以進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)，因此，研究磷脂酶A1基因在工程菌中的克隆表達(dá)并努力提高其產(chǎn)量成為近年來(lái)的主要研究方向。國(guó)內(nèi)外利用微生物產(chǎn)磷脂酶A1的起步較晚，且產(chǎn)量普遍較低:1988年，MichaelGivskova等從液化沙 雷氏菌中提取磷脂酶A1基因在大腸桿菌克隆和表達(dá)，其酶活不到IU/ml (Givskov M, Molin S.Secretion of Serratia liquefaciens phospholipase fromEseherichia.coli [J].Mol.Microbiol, 1993 (8):229-42.) ；2000 年，M.Hartmann 等使用隨機(jī)化學(xué)突變、單細(xì)胞融合以及基因雜交技術(shù)，篩選出4株嗜熱四膜蟲(chóng)屬突變株，其酶活最高達(dá)至丨J 35.2 + 2.60U/ml (Hartmann M, etal.Screening forand charaeterizationofphospholipase A1 hypersecretory mutants of Tetrahymena thermophila[J].Appl.Microbiol.Biotechnol，2000 (54):390-396) ；2008年，國(guó)內(nèi)付建紅等從新疆天山一號(hào)冰川凍土中篩選到一株產(chǎn)低溫堿性磷脂酶A1的菌株xjFl，初步優(yōu)化后，酶活力最高達(dá)17.5U/ml(付建紅，唐輝桂，姚斌，等.一株產(chǎn)低溫堿性磷脂酶A1耐冷細(xì)菌的篩選及發(fā)酵條件的初步研究.工業(yè)微生物2008.38:12-16.)。目前商品化的磷脂酶A1產(chǎn)品僅有丹麥諾維信公司的Lecitase Novo (Novozymes A/S),其是通過(guò)蛋白質(zhì)修飾技術(shù)由來(lái)源于嗜熱絲胞菌的脂肪酶改性而來(lái)。因此，尋找更加優(yōu)良的磷脂酶A1基因并在工程菌中進(jìn)行克隆表達(dá)以期提高其表達(dá)水平是亟待解決的問(wèn)題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，本專(zhuān)利技術(shù)的目的在于提供一株重組大腸桿菌及用該菌株制備磷脂酶A1的方法。利用該菌株通過(guò)液體發(fā)酵制備磷脂酶A1，具有產(chǎn)酶量和酶活性高、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成本低、易于工藝放大等優(yōu)點(diǎn)。本專(zhuān)利技術(shù)的技術(shù)方案如下:一株重組大腸桿菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)/pET-pla，保藏編號(hào)為 CCTCCM 2012423，該重組大腸桿菌包含一段來(lái)源于液化沙雷氏菌CICCN0.21538的pla基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。其進(jìn)一步的技術(shù)方案為:所述重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-pla，CCTCC N0.M 2012423由下述方法制得:(I)以所述液化沙雷氏菌CICC N0.21538的基因組為模板，克隆得到所述pla基因；(2)將步驟(I)所得pla基因克隆到表達(dá)載體pET-28a ( + )上，得到重組載體pET-pla ；(3)將步驟(2)所得重組載體pET-pla轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建得到能表達(dá)磷脂酶A1的重組大腸桿菌。本專(zhuān)利技術(shù)還提供了一種用上述重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET_pla，CCTCC N0.M2012423制備磷脂酶A1的方法，是以該重組大腸桿菌為發(fā)酵菌株進(jìn)行液體發(fā)酵，制備磷脂酶A1O具體步驟如下:(I)種子培養(yǎng):將經(jīng)過(guò)斜面培養(yǎng)的所述重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET_pla，CCTCCN0.M 2012423單菌落接種于種子培養(yǎng)基，于35 37°C振蕩培養(yǎng)5 7h，搖床轉(zhuǎn)速180 200r/min ；(2)自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng):將上述種子培養(yǎng)所得活化種子液按體積百分比I 4%的接種量接種至自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基，于3`5 37°C振蕩培養(yǎng)3 5h小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速180 200r/min ;再向所述自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加其總重量0.5 2%的甘氨酸和曲拉通，繼續(xù)培養(yǎng)12 14h ;發(fā)酵完畢，得到發(fā)酵液；(3)粗酶液的提取:將上述發(fā)酵液離心，收集上清液，即得含磷脂酶A1的粗酶液。其進(jìn)一步的技術(shù)方案為:步驟(I)所述斜面培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分以IL計(jì)為:蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖8g，氯化鈉1，其余成分為水，調(diào)節(jié)pH值至7.4 ;所述種子培養(yǎng)基成分以IL計(jì)為:蛋白胨10g，酵母粉 5g，葡萄糖 8g，Na2HPO4 25mM, KH2PO4 25mM, NH4Cl 50mM, Na2SO4 5mM, MgSO4 2mM，其余成分為水；上述種子培養(yǎng)基還包括終濃度為100μ g/ml的卡那霉素。步驟(2)所述自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基成分以IL計(jì)為:蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖0.5g,乳糖 2g,甘油 5g, Na2HPO4 25mM, KH2PO4 25mM, NH4Cl 50mM, Na2SO4 5mM, MgSO4 2mM,FeCl3 50 μ M, CaCl2 20 μ M，其余成分為水。磷脂酶A1酶活測(cè)定方法如下:采用改良NaOH 滴定法(Sheelu 等，J Am Oil Chem Soc 85:739-748，2008)。將 4g已乳化的大豆卵磷脂溶于100ml 50mM的磷酸緩沖液(pH 7.0)，取20ml該溶液和稀釋5倍的粗酶液在轉(zhuǎn)速為180r/min的恒溫震蕩水浴鍋中于50°C預(yù)熱10分鐘；取200 μ L已稀釋的粗酶液加入上述反應(yīng)體系中精確反應(yīng)10分鐘，立即補(bǔ)加15ml的95%乙醇終止反應(yīng)。用已標(biāo)定的30mmol/L NaOH溶液滴定上述粗酶液中磷脂酶A1所釋放的游離脂肪酸，取pH8.2為滴定終點(diǎn)；磷脂酶A1酶活力定義為:在上述反應(yīng)條件下，每分鐘釋放I μ mol的游離脂肪酸的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。本專(zhuān)利技術(shù)所提供的重組大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET_pla,已于2012年10月24日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào):CCTCC NO:M 2012423，地址:中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)。該菌株以下簡(jiǎn)稱(chēng):重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-pla CCTCCM 2012423。本專(zhuān)利技術(shù)的有益技術(shù)效果如下:本專(zhuān)利技術(shù)成功構(gòu)建了一株磷脂酶A1基因來(lái)源于液化沙雷氏菌CICC N0.21538的基因重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-pla CCTCC M 2012423，分析結(jié)果表明，該重組大腸桿菌所包含的磷脂酶A1基因(pla基因，核苷酸序列如SEQ 本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一株重組大腸桿菌（Escherichia?coli）BL21（DE3）/pET?pla，保藏編號(hào)為CCTCC?No.M?2012423，其特征在于：該重組大腸桿菌包含一段來(lái)源于液化沙雷氏菌CICC?No.21538的pla基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。
【技術(shù)特征摘要】
1.一株重組大腸桿菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)/pET-pla，保藏編號(hào)為 CCTCCN0.M 2012423，其特征在于:該重組大腸桿菌包含一段來(lái)源于液化沙雷氏菌CICC N0.21538的Pla基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-pla，CCTCC N0.M2012423，其特征在于由下述方法制得: Cl)以所述液化沙雷氏菌CICC N0.21538的基因組為模板，克隆得到所述pla基因； (2)將步驟(I)所得pla基因克隆到表達(dá)載體pET-28a( + )上，得到重組載體pET-pla ； (3)將步驟(2)所得重組載體pET-pla轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建得到能表達(dá)磷脂酶A1的重組大腸桿菌。3.用權(quán)利要求1 2任一項(xiàng)所述重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-pla，CCTCCN0.M2012423制備磷脂酶A1的方法，其特征在于以該重組大腸桿菌為發(fā)酵菌株進(jìn)行液體發(fā)酵，制備憐脂酶A1。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備磷脂酶A1的方法，其特征在于具體步驟如下: (1)種子培養(yǎng):將經(jīng)過(guò)斜面培養(yǎng)的所述重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-pla，CCTCC N0.M2012423單菌落接種于種子培養(yǎng)基，于35 37°C振蕩培養(yǎng)...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張梁，石貴陽(yáng)，延晉雷，丁重陽(yáng)，顧正華，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：江南大學(xué)，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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