一株腫瘤靶向細菌及其菌劑制備方法與代謝產物，該腫瘤靶向細菌是昆蟲病原線蟲共生致病桿菌HN_xs01，XenorhabdusstockiaeHN_xs01；該菌種于2012年03月09日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，菌種保藏編號為CCTCCNO：M2012069。本發(fā)明專利技術還包括該腫瘤靶向細菌的菌劑制備方法與代謝產物。本發(fā)明專利技術之腫瘤靶向細菌通過靜脈注射后能特異積聚于小鼠腫瘤部位，而在小鼠的肝、腎、脾等正常組織和器官不能定殖，具有極強的腫瘤靶向性，通過最終腫瘤的重量比較，得到抑瘤率為60~100%，對小鼠黑色素瘤表現(xiàn)出很好的體內抗腫瘤效果。
【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術涉及一株腫瘤靶向細菌及其菌劑制備方法與代謝產物，尤其是涉及一株腫瘤靶向細菌昆蟲病原線蟲共生致病桿菌及其菌劑制備方法與代謝產物。
技術介紹
癌癥已成為當今世界人類的主要殺手。傳統(tǒng)治療癌癥的方法如放射療法、化學療法以及外科手術切除法，對一半的癌癥患者沒有效果。隨著醫(yī)療技術的進步，光能療法、人類α -乳清蛋白療法(HAMLET)、高溫療法、射頻療法、飲食療法、胰島素增強療法、基因治療、端粒酶治療、二氯乙酸(DCA)治療和細菌治療等方法被用于癌癥的治療，但這些新的方法都有各自的弊端，無法大規(guī)模用于臨床治療。靶向抗腫瘤是指在特定的導向機制作用下，將具有抗腫瘤活性的物質輸送到腫瘤部位，但在機體其他組織或器官中不存在或存在很少，從而起到特異性殺傷腫瘤的效果，其具有用藥量少、專一性強、毒副作用低、作用時間長等特點。近年來，細菌靶向治療腫瘤成為一大研究熱點。腫瘤內部存在低氧區(qū) ，是傳統(tǒng)的腫瘤治療如放療、化療等方法效果不佳的主要原因，但部分厭氧或兼性厭氧細菌能在此微環(huán)境中繁殖生長，通過競爭有限的營養(yǎng)、分泌細胞毒素來消除腫瘤，而不會擴散到機體其他部位。另外，細菌具有能動性、抗生素敏感性及載運和表達多種抗腫瘤藥物的能力，突顯了其在臨床應用中的潛力。細菌靶向治療腫瘤在經(jīng)過長時間且廣泛的研究后，先后挖掘出梭狀芽孢桿菌sp.)、鼠傷寒沙門氏菌(51 CAoJeraei1Swi1S )、雙歧桿菌 iB.大腸桿菌 iE.coli )、霍亂弧菌(Kcholerae )、單核細胞增多性李斯特細菌iL.monocytogenes )等細菌用于祀向腫瘤治療，但這些細菌作用方式單一且存有各種不足，如具有較強毒力的菌株在殺死腫瘤細胞的同時也對機體產生較強的毒性，而毒性較弱的菌株雖然有很高的腫瘤靶向性且對機體毒力較弱，但對腫瘤抑制效果較弱；對于壞死區(qū)域較小的早期腫瘤及外圍含氧量較高的腫瘤，不適合厭氧菌的生長，兼性厭氧菌雖能彌補這一缺點，但腫瘤靶向性不強。昆蟲病原線蟲共生菌是 一類與線蟲互惠共生的革蘭氏陰性細菌，屬腸桿菌科，存在于線蟲腸道內，分為致病桿菌屬(ifeflorAaAofesp.)和發(fā)光桿菌屬(/jAoioraAAofesp.),分別與斯氏線蟲(Sieifleraeaa)和異小桿線蟲(ZfeterorAaMZii1S)共生，已有的研究表明該類細菌具有廣譜高效殺蟲、抑菌及體外抗腫瘤等生物活性，但有關該類細菌的體內抗腫瘤效果和腫瘤靶向性研究國內外尚無報道。雖然有關細菌靶向治療腫瘤的研究起始較早，但在已經(jīng)研究過的細菌中，具有較好抗腫瘤效果和較強腫瘤靶向性且對機體毒性較小的野生型菌株存在極少。厭氧細菌雖能特異積聚于腫瘤的無氧區(qū)，但在較大腫瘤的外圍區(qū)域或早期腫瘤內，受到氧氣影響而無法生存，對腫瘤的消除不徹底；兼性厭氧細菌雖能存在于腫瘤的有氧區(qū)域，但腫瘤靶向性不強，同時也能分布于機體的其他組織或器官中。高毒力菌株雖能對腫瘤具有較強的殺傷作用，但其同時也對機體有較大的毒副作用；低毒力菌株雖對機體毒副作用較低，但其抗腫瘤效果不強。昆蟲病原線蟲共生菌是一類與線蟲互惠共生的革蘭氏陰性細菌，存在于線蟲腸道內，屬腸桿菌科(Enterobacteriaceae),人們對該類細菌的研究起步相對較晚,主要集中于殺蟲和抑菌兩個方面，而在抗腫瘤方面的研究極少，只是初步嘗試了個別菌株的體外抗腫瘤細胞活性。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術要解決的技術問題是，克服現(xiàn)有技術的不足，提供一株腫瘤靶向細菌及其菌劑制備方法與代謝產物，該菌株具有極強的腫瘤靶向性，并且其菌劑與代謝產物具有較好的體內抗腫瘤效果。本專利技術解決所述技術問題采用的技術方案是: 一株腫瘤祀向細菌，是昆蟲病原線蟲共生致病桿菌HN_xs01 {Xenorhabdus stockiaeHN_xs01);該菌種于2012年03月09日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址:中國.武漢.武漢大學)，保藏編號為CCTCC NO:M 2012069。本專利技術之腫瘤革巴向細菌一昆蟲病原線蟲共生致病桿菌HN_xs01 iXenorhabdusstockiae HN_xs01)的分離鑒定:采用土壤線蟲分離法，結合NBTA鑒別培養(yǎng)基(NBTA培養(yǎng)基)，從云南德宏傣族景頗族自治洲盈江縣太平鄉(xiāng)采集的土樣中直接分離得到一株具有昆蟲病原線蟲共生菌性狀的藍色細菌，經(jīng)菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色、鏡檢和16S rRNA基因同源性分析等方法鑒定該菌株為屬，stockiae種,命名為昆蟲病原線蟲致病桿菌 HN_xs01(J6WorAaA￡//75.stockiae HN_xs01),其 16S rRNA 基因在 Genbank 中的登錄號為HQ840745.1。本專利技術之腫瘤靶向細菌一昆蟲病原線蟲共生致病桿菌HN_xs01菌劑制備方法: 利用昆蟲病原線蟲共生致病桿菌HN_xs01易于培養(yǎng)，發(fā)酵周期短的特性，制備該菌`體制劑。主要工藝流程包括菌種活化、一級發(fā)酵培養(yǎng)、二級種子罐發(fā)酵培養(yǎng)和生產用發(fā)酵罐培養(yǎng)，發(fā)酵完成后，收集菌液，離心收集菌體，生理鹽水洗滌，快速冷凍，真空干燥并包裝，-20°C保藏，使用時，根據(jù)個體差異用生理鹽水溶解通過瘤內或靜脈給藥?；罹鷦┲苽涞木唧w過程如下: (1)菌種活化，將保藏于-80°C冰箱中的昆蟲病原線蟲共生致病桿菌HN_xs01劃線接種于NBTA培養(yǎng)基上，30°C條件倒置培養(yǎng)36 48 h ;然后挑取單菌落劃線，以作進一步的純化； (2)一級發(fā)酵培養(yǎng)和二級種子罐發(fā)酵培養(yǎng):挑取經(jīng)再次純化后的stockiae HN_xs01接種LB液體培養(yǎng)基中，30°C下18(T200 rpm振蕩培養(yǎng)12h至對數(shù)生長中期，然后將10 mL培養(yǎng)液接種于1000 mL LB液體培養(yǎng)基中，30°C下180 200 rpm振蕩培養(yǎng)12 24h，得一級種子罐發(fā)酵菌液；將二級種子罐在121°C下滅菌30min，裝入發(fā)酵罐培養(yǎng)基后再滅菌，冷卻至25 3(TC，將一級種子罐發(fā)酵液按體積比4% 5%接種量接入二級種子罐，通入無菌空氣1.8立方米/小時，并以180 rpm的速度攪拌進行培養(yǎng)，培養(yǎng)12 24h，得二級種子罐發(fā)酵菌液； (3)生產用發(fā)酵罐培養(yǎng)，先將發(fā)酵罐滅菌，121°C，壓力1.2-1.3 kg/cm2條件下滅菌30min,裝入發(fā)酵罐培養(yǎng)基后再以121 °C條件滅菌25min，保壓降溫至25°C 30°C，按體積比4 % 5 %的接種量將二級種子罐發(fā)酵液接入發(fā)酵罐中培養(yǎng)，通入無菌空氣，通氣量3升/分鐘，溫度30°C，攪拌轉速為200rpm，培養(yǎng)36h ； (4)制備制劑:當菌體的發(fā)酵液密度> 20^171,菌體量不足1020^171時放罐，收集菌液，11000 rpm, 2 min離心收集菌體,生理鹽水洗漆6_8遍,先使微生物在極低溫度_70°C下快速冷凍，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分(真空干燥，真空度-0.1Mpa，真空包裝在玻璃瓶中，_20°C保藏，即成。使用時，根據(jù)個體差異用生理鹽水溶解，通過瘤內或靜脈給藥。所述培養(yǎng)基的配方及制備: LB液體培養(yǎng)基配方:蛋白胨10 g-Γ1, NaCl 10 g L—1，酵母提取物5 g L—1，水溶，滅菌前pH值7.0 7.4，121 °C，20 min條件濕熱滅菌； NBT本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
一株腫瘤靶向細菌，其特征在于，是昆蟲病原線蟲共生致病桿菌HN_xs01，Xenorhabdus?stockiae?HN_xs01；該菌種于2012年03月09日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，菌種保藏編號為CCTCC?NO：M?2012069。
【技術特征摘要】
1.一株腫瘤靶向細菌，其特征在于，是昆蟲病原線蟲共生致病桿菌HN_XS01，Xenorhabdus stockiae HN_xs01 ;該菌種于2012年03月09日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，菌種保藏編號為CCTCC NO:M 2012069。2.一株制備如權利要求1所述腫瘤靶向細菌菌劑的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)菌種活化，將保藏于_80°C冰箱中的昆蟲病原線蟲共生致病桿菌HN_xs01劃線接種于NBTA培養(yǎng)基上，30°C條件倒置培養(yǎng)36 48 h ;然后挑取單菌落劃線，以作進一步的純化； (2)一級發(fā)酵培養(yǎng)和二級種子罐發(fā)酵培養(yǎng):挑取經(jīng)再次純化后的stockiae HN_xs01接種LB液體培養(yǎng)基中，30°C下180 200 rpm振蕩培養(yǎng)12h至對數(shù)生長中期，然后將10 mL培養(yǎng)液接種于1000 mL LB液體培養(yǎng)基中，30°C下180 200 rpm振蕩培養(yǎng)12 24h，得一級種子罐發(fā)酵菌液；將二級種子罐在121°C下滅菌30min，裝入發(fā)酵罐培養(yǎng)基后再滅菌，冷卻至25 3(TC，將一級種子罐發(fā)酵液按體積比4% 5%接種量接入二級種子罐，通入無菌空氣1.8立方米/小 時，并以180 rpm的速度攪拌進行培養(yǎng)，培養(yǎng)12 24 h，得二級種子罐發(fā)酵菌液； (3)生產用發(fā)酵罐培養(yǎng)，先將發(fā)酵罐滅菌，121°C，壓力1.2-1.3 kg/cm2條件下滅菌30min，裝入發(fā)酵罐培養(yǎng)基后再以121°C條件滅菌25 min，保壓降溫至25°C...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：夏立秋，張友明，張超，丁學知，
申請(專利權)人：湖南師范大學，
類型：發(fā)明
國別省市：
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