本發明專利技術涉及一株糞腸球菌（Enterococcus?faecalis）FJL19，其保藏編號為CGMCC?No.6995。本發明專利技術還提供了上述糞腸球菌FJL19具有抑制雞腸道中大腸桿菌生長、促進雛雞生長的作用。本發明專利技術從籠養成年蛋雞空腸中分離出糞腸球菌FJL19，此菌株生長旺盛，18小時培養菌數就可達5.1×109cfu/ml，且具有抑菌作用，可以利用培養基生產抑菌蛋白，降低雛雞腸道大腸桿菌數量；通過此乳酸菌制備菌制劑飼喂雛雞，可以提高雛雞的生長；因此糞腸球菌FJL19在動物飼養尤其是家禽新型飼料添加劑開發和抗生素替代品研究上具有重大的社會意義和經濟價值。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于動物微生物領域，涉及一株糞腸球菌F幾19及其應用，特別涉及一株從雞腸道中分離出來的糞腸球菌FJL19及其應用。
技術介紹
乳酸菌是一類重要的益生菌，是動物腸道中一類重要的優勢菌群。乳酸菌制劑作為一種新型的綠色動物微生態制劑，因其無毒、無抗藥性、無殘留、無副作用而備受飼料界的廣泛關注。采用乳酸菌作為益生菌飼喂動物，除了由于乳酸菌具有一定的營養作用和對腸道的粘附作用外，主要在于乳酸菌對于一些腐敗菌和有害菌具有抑制作用。第一，乳酸菌可以產生乳酸，創造酸性環境抑制有害菌及不耐酸的腐敗菌生長；第二，乳酸菌產生H2O2,激活過氧化氫酶一硫氰酸系統，抑制和殺滅革蘭氏陰性菌、過氧化氫酶陽性細菌等；第三，部分乳酸菌可以產生抑菌性的細小蛋白質或肽類，稱為細菌素，對大腸桿菌等致病菌有拮抗作用。而且，有了產生抑菌蛋白的乳酸菌，就可以生產細菌素，可以替代抗生素，使動物生產更安全。分離篩選可以產生細菌素的乳酸菌成為現在益生菌開發的研究熱點。產生細菌素的乳酸菌來源很多，購買的工業菌株和標準菌株，有很多也可以產生細菌素，環境、土壤、泡菜、酸奶中都可以分離乳酸菌。然而益生菌最后要飼喂動物，那么相對于其他來源的菌株，動物無疑是乳酸菌的最好來源。來自動物腸道的乳酸菌可以適應動物腸道環境，耐受動物的胃酸和膽鹽的消化，無疑是最好的益生菌來源。可見，通過從動物腸道分離和篩選能夠產生細菌素的乳酸菌將是動物用益生菌篩選的重要研究方向。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一株糞腸球菌(Enterococcus faecalis)FJL19,其保藏編號為 CGMCC N0.6995。本專利技術的第二個目的是提供上述糞腸球菌F幾19具有抑制雞腸道中大腸桿菌生長、促進雛雞生長的作用。本專利技術通過以下技術方案來實現:一、一株幾腸球菌(Enterococcus faecalis) FJL19,其保藏編號為 CGMCCN0.6995。本專利技術中糞腸球菌F幾19為革蘭氏陽性，形態為球形，是從籠養成年蛋雞盲腸內容物中分離的乳酸菌菌株，經過產抑菌蛋白等特性測定篩選得到的目標菌株。篩選的具體步驟如下:1、乳酸菌分離純化:采用無菌操作， 用載玻片刮取籠養成年蛋雞盲腸內容物lg，置于盛有9mL無菌生理鹽水的玻璃試管中，充分震蕩搖勻，然后吸取0.5mL混合液于盛有4.5mL無菌生理鹽水的試管中，此稀釋度為10—1，重復以上過程作10倍比稀釋，至10_6稀釋濃度，選擇10_4、10_5、10_6三個稀釋度，吸取0.1mL菌液滴于MRS培養基平板上，平板涂布后采用厭氧培養法(5%C02)將涂好的培養皿置37°C培養箱培養48h。采用四分區劃線法，用接種環挑取形態不同的菌落在MRS瓊脂培養基上進行劃線分離培養，經48h培養后，在四分區中挑取分離效果好的菌落用接種環接種于MRS斜面培養基上作純培養，重復傳代純培養3次，而后置于4°C冰箱保存備用。2、菌體形態的觀察取干凈玻片，用接種環取一環無菌水于玻片上，而后挑取少量細菌，涂勻，待干燥后，固定。革蘭氏染色:先用草酸銨結晶紫染液染色lmin，用水沖洗，接著滴加盧氏碘液覆蓋lmin,用水沖洗,然后滴加95%乙醇至乙醇液不呈現紫色時停止約0.5min,最后用番紅染液復染lmin，水洗。油鏡鏡檢(16X100)，選取革蘭氏染色為陽性、形態為桿狀或球狀的菌株做后備菌株留用。革蘭氏染色試劑配制:①草酸銨結晶紫染色液的配 制A液結晶紫2g 95%酒精20mLB液草酸銨0.8g蒸餾水80mL混合A、B液,靜置48h之后使用。②盧氏碘液碘片Ig碘化鉀2g蒸餾水300mL先將鵬化鐘溶解在少量水中，再將鵬片溶解在鵬化鐘溶液中，待鵬全溶后加足水即可。③95%酒精④番紅復染液番紅2.5g 95% 酒精 IOOmL取上述配好的番紅酒精IOmL與80mL蒸餾水混勻而成。3、抑菌性乳酸菌的篩選:(I)菌液的制備:將分離純化出的乳酸菌活化2-3代后，按2%(v/v)的接種量各自接至新鮮MRS液體培養基中，37°C厭氧培養24h，使其菌液濃度達到108cfu/mL，測定其抑菌活性。將黃色微球菌接種于肉湯培養基中，于37°C搖床培養2代，用無菌水作10倍比稀釋，使其菌液濃度達到105cfu/mL，作為指示菌備用。(2)產酸能力測定:將分離純化出的乳酸菌活化2-3代后，按2%(v/v)的接種量接至各自新鮮MRS液體培養基中，37°C厭氧培養，分別于0h、48h兩個時間點用酸度計測定各實驗菌株5mL發酵液的pH值。每個試驗菌株發酵液作3個重復，取平均數。用0h、48h兩個時間點各實驗菌株發酵液的PH值變化，即A pH值來衡量乳酸菌的產酸能力。選取產酸能力聞的菌株進行下一步測定。(3)抑菌實驗:采用牛津杯法對分離純化出的乳酸菌進行抑菌效果測定。取IOOii L指示菌液分別滴加到已凝固好的培養基中，用涂布棒涂布均勻。在無菌條件下用無菌鑷子夾取4個牛津杯對稱放在平皿上，然后分別吸取200 u L乳酸菌發酵液于3個牛津杯中，另一個牛津杯中加入等量的MRS培養液作對照，于37°C下恒溫培養16-18h。每個乳酸菌發酵液做2個重復，用游標卡尺測其抑菌圈直徑的大小，取平均數，選擇抑菌環大的乳酸菌。為了盡快篩選出所需菌種，初步篩選采用了抑菌和產酸能力2項基本指標加和淘汰法。每項指標中，排在首位的加100分，位居第二的加99分，以此類推，排在最后的加I分。對初篩試驗的2項結果各自進行加和并排序，選出總分較高的前10名菌株進行下一步研究。4、產細菌素乳酸菌的篩選將步驟2中篩選到的乳酸菌進行液體培養，為了減少酸的抑菌效果，對培養液用lmol/L NaOH溶液調整pH值至6.8，然后進行牛津杯法測定抑菌環，方法同上，選擇抑菌環最大的乳酸菌。再進行液體培養后，在培養液中加入0.lmg/L的蛋白酶37°C作用2h，取菌液做抑菌試驗，篩選沒有抑菌環的菌株，為產生抑菌蛋白的目標乳酸菌。在上述篩選方法中，培養基為MRS培養基:固體平板或斜面培·養基:胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸銨2g，葡萄糖20g，磷酸二氫鉀2g，乙酸鈉5g，吐溫_801g，硫酸鎂0.5g，硫酸錳0.2g，瓊脂20g，蒸餾水IOOOmL,pH6.8。液體培養基:胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸銨2g，葡萄糖20g，磷酸二氫鉀2g，乙酸鈉5g，吐溫_801g，硫酸鎂0.5g，硫酸錳0.2g，蒸餾水IOOOmL, pH6.8。采用上述技術方案的積極效果:本專利技術從籠養成年蛋雞空腸中分離出糞腸球菌FJL19，此菌株生長旺盛，18小時培養菌數就可達5.lX109cfu/mL，且具有抑菌作用，可以利用培養基生產抑菌蛋白，降低雛雞腸道大腸桿菌數量；通過此乳酸菌制備菌制劑飼喂雛雞，可以提高雛雞的生長；因此糞腸球菌F幾19在動物飼養尤其是家禽新型飼料添加劑開發和抗生素替代品研究上具有重大的社會意義和經濟價值。附圖說明圖1是糞腸球菌的革蘭氏染色鏡檢結果；圖2是糞腸球菌菌液的抑菌效果對比；圖中，1、2為目的菌株的抑菌圈，3、4為其他分離菌株的抑菌圈；圖3是蛋白酶處理后糞腸球菌菌液的抑菌效果；圖中，I為未處理的菌液，2、3和4分別為蛋白酶K，胰蛋白和木瓜蛋白酶處理的菌液；圖4是糞腸球菌的PCR擴增結果；圖中，IMark本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一株糞腸球菌（Enterococcus?faecalis）FJL19，其保藏編號為CGMCC?No.6995。
【技術特征摘要】
1.一株幾腸球菌(Enterococcus faecalis) FJL19,其保藏編號為 CGMCC ...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王秋菊，崔一喆，劉勝軍，孫蕊，張愛忠，
申請(專利權)人：黑龍江八一農墾大學，
類型：發明
國別省市：
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