本發明專利技術公開了一種CRP單克隆抗體、CRP抗體納米乳膠微球組合物及制備工藝；所述CRP抗體納米乳膠微球組合物為不同抗原表位的CRP單克隆抗體，與不同粒徑的羧基化聚苯乙烯微球共價交聯形成偶聯物，然后將不同偶聯物按一定比例混合制成CRP單克隆抗體納米乳膠微球組合物。本發明專利技術所述的CRP單克隆抗體納米乳膠微球組合物與全自動生化分析儀、特種蛋白分析儀匹配，可全量程測定人全血和血清中C反應蛋白濃度，應用于細菌與病毒性感染的鑒別診斷、藥物治療監測及心血管疾病的風險評估。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于醫學免疫領域,涉及C反應蛋白(c-reactive protein, CRP)單克隆抗體(Monoclonal antibody, McAb)的制備,涉及C反應蛋白單克隆抗體納米乳膠微球的偶聯，涉及不同C反應蛋白抗體納米乳膠微球偶聯物的組合，還涉及C反應蛋白的檢測應用。
技術介紹
C反應蛋白是可在急性炎癥病人血清中濃度升高的可以結合肺炎球菌細胞壁C多糖的蛋白質。人類C反應蛋白至少可以有兩種存在形式，一種是由五個相同的亞基以非共價鍵形成五聚體(pentameric CRP, pCRP),這是血清中CRP主要存在形式；另一種為單個亞基的單體(modified/monomeric CRP,mCRP),可由五聚體在活化的血小板膜上分解形成。作為一種急性時相反應蛋白，血漿中CRP濃度在正常人中含量極微，一般新生兒血清CRP水平小于2mg/L，兒童和成人小于10mg/L，但在急性心肌梗死、創傷、感染、炎癥、外科手術、腫癌浸潤時迅速顯著的增高，可達正常水平數百倍甚至上千倍。CRP上升速度、幅度和持續時間與病情和組織損傷的嚴重程度密切相關，因此作為炎癥和組織損傷的非特異性標志物被廣泛應用于臨床疾病診斷和風險評估。CRP濃度的臨床檢測方法主要有膠乳凝集法、免疫層析法、化學發光法、放射免疫法、酶聯免疫吸附法及乳膠增強比濁法等，其中乳膠增強比濁法是目前公認檢測效率最高的方法。CRP檢測按其濃度檢測范圍大致分為兩類:第一類是普通CRP檢測，檢測范圍通常在3-200mg/L，但其線性范圍不能覆蓋微量CRP。第二類是高敏CRP (high-sensitivityCRP, hs-CRP)檢測，它比常規檢測方法更敏感，靈敏度可低于0.3mg/L,能準確定量0.ri0mg/L濃度范圍內的CRP，臨床上用于評估心臟病發病風險，但是高敏CRP試劑無法檢測更高濃度的CRP。目前在國內用乳膠增強免疫比濁法測定CRP的試劑盒中，其致敏乳膠微球的抗體大多為CRP多克隆抗體(Polyclonal antibody, PcAb),或是采用兩種粒徑微球分別偶聯CRP多克隆抗體后混合作為反應試劑。這些試劑盒有以下不足:首先，雖然多克隆抗體乳膠微球比單克隆抗體乳膠微球具有更高的靈敏度，但線性范圍較窄，單獨使用不易達到CRP全程測量的要求；其次，單一粒徑的微球偶聯CRP多克隆抗體制備乳膠微球增強免疫比濁試劑，無法同時測定高濃度和低濃度水平下的CRP含量。
技術實現思路
本專利技術的目的是針對上述技術上的不足，提供多株互補配對的CRP單克隆抗體及多克隆抗體，并與納米乳膠微球偶聯，偶聯物按比例混合制成組合物，應用于CRP免疫定量試劑盒的制備，可與全自動生化分析儀、特種蛋白分析儀等儀器匹配進行免疫透射和免疫散射比濁測定人全血、血清CRP濃度，實現CRP全量程檢測。為實現上述目的，本專利技術提供以下技術方案:選擇高親和力的CRP單克隆抗體的多株互補配對亞型，用特殊工藝分別與合適粒徑的羧基化聚苯乙烯微球偶聯，制成CRP單克隆抗體納米乳膠微球偶聯物，該偶聯物可按不同的比例與CRP多克隆抗體乳膠微球偶聯物混合，從而提聞CRP檢測的性能指標。本專利技術可應用于免疫比濁法(散射免疫/透射免疫比濁)測定人血CRP濃度。本專利技術的具體步驟如下:1，從人血清純化天然CRP作為免疫原，制備高特異性、高親和力、高純度的CRP單克隆抗體。2，選擇合適粒徑的羧基化聚苯乙烯微球，通過1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(l-Ethyl-3-(3-dimethyl laminopropyl) carbodiimidehydrochloride, EDAC)活化微球表面的羧基，生成活性酯，再與CRP單克隆抗體上的伯胺基反應，形成共價鍵，完成交聯，獲得CRP單克隆抗體乳膠微球偶聯物。3，選擇合適的儲存液懸浮CRP單克隆抗體乳膠微球偶聯物，或將不同CRP抗體乳膠微球偶聯物按一定比例混合，配制成適合CRP檢測的試劑，使其同時滿足高靈敏度和寬線性范圍的要求，用于臨床上乳膠增強免疫比濁法檢測CRP濃度。步驟I所述的CRP單克隆抗體是用人C反應蛋白免疫，可以是人源性、鼠源性或兔源性等,但并不限于此。CRP單克隆抗體來源可以是雜交瘤細胞免疫動物的腹水，也可以是CHO細胞表達，或雜交瘤無血清培養。純化方式為硫酸銨沉淀和親和柱純化。所獲得的抗體具有互補配對的不同抗原識別表位，可以是不同的抗體亞型，其抗原抗體親和力(affinity) Ka 彡 IXlO8M'步驟2所述的交聯方法為碳二亞胺法。碳二亞胺是一類很強的脫水劑，能使羧基與氨基脫水形成酰胺鍵。本專利技術選用EDAC作為交聯劑，它屬于碳二亞胺類中可溶于水的一種，適用于蛋白質的偶聯。ED AC與羧基反應形成O-酰基異硫脲中間體，該中間體易于水解，在水溶液中很不穩定。該中間體(O-酰基異硫脲)在N-羥基硫代琥珀酰亞胺(N-hydroxysulfosuccinimide, Sulfo-NHS)存在的情況下,可以形成具有與氨基反應活性的NHS-活性酯，這種NHS-活性酯中間體非常穩定。因此，本專利技術選用EDAC和Sulfo-NHS活化羧基微球，可提聞活化效率。步驟2所述的聚苯乙烯微球粒徑在50_500nm。其中，小粒徑微球偶聯弱親和力單克隆抗體，可提高測試的線性范圍。大粒徑微球偶聯強親和力單克隆抗體，可提高檢測靈敏度。與每毫克聚苯乙烯微球交聯的抗體量可根據檢測需要進行調整，范圍可以是0.03-1毫克。步驟3所述的偶聯物，是指CRP單克隆抗體和羧基聚苯乙烯微球共價交聯的偶聯物，該偶聯物可以是同種微球偶聯不同亞型的CRP單克隆抗體，也可以是不同粒徑微球偶聯不同亞型的CRP單克隆抗體。將幾種偶聯物懸液按不同比例混合，可拓寬CRP乳膠增強免疫比濁法檢測的線性范圍。本專利技術所述CRP單克隆抗體納米乳膠微球組合物還涉及乳膠微球的懸浮緩沖液(儲存液)和與抗原反應的緩沖液(反應液)。本專利技術所涉及緩沖液可選用具有相似性質的一種或幾種:磷酸鹽緩沖液、檸檬酸-磷酸鹽緩沖液、2-嗎啉乙磺酸緩沖液、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液、羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液、氯化銨緩沖液及甘氨酸緩沖液等。儲存液可選擇上述一種合適緩沖液，鹽濃度在20_300mM。其中可添加蛋白穩定劑，如蔗糖(參考濃度5-15%)、SDS (參考濃度0.005-0.03%)等，還可添加非離子表面活性劑，如 TritonX-1OO (參考濃度 0.005-0.05%)。反應液可選擇上述一種合適緩沖液，其中可添加非離子表面活性劑和加速反應的增濁劑，如聚乙二醇4000 (參考濃度0.05-3%)和吐溫20 (參考濃度0.01-0.05%)等。溶血劑在檢測樣本為全血時也可添加。儲存液和反應液中可添加防腐劑如疊氮鈉(參考濃度小于0.1%)和小牛血清蛋白(參考濃度0.05-1%)。本專利技術具有以下特性與效果:1.本專利技術所涉及的CRP單克隆抗體所使用的免疫原是從人血清純化而來，比CRP重組蛋白有更多天然抗原表位。通過動物免疫、細胞融合、篩選和克隆化，優選出7C1 (IgG)和OTl(IgG)兩種互補配對的雜交瘤細胞亞型。經細胞培養或接種小鼠，獲得高親和力的單抗，其抗原親和力均高于IXlO8M'本項目建立的雜交瘤細胞大規模培養工藝，使生本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種C反應蛋白（CRP）抗體，其特征是：所述CRP抗體為人血清純化天然CRP作為免疫原，制備而得的互補配對單克隆抗體或多克隆抗體。
【技術特征摘要】
1.一種C反應蛋白(CRP)抗體，其特征是:所述CRP抗體為人血清純化天然CRP作為免疫原，制備而得的互補配對單克隆抗體或多克隆抗體。2.如權利要求1所述的CRP抗體，其特征是:所述的單克隆抗體雜交瘤細胞株為7C1和5D1。3.—種CRP單克隆抗體納米乳膠微球組合物，其特征是:所述納米乳膠微球組合物為權利要求1或者2所述的單克隆抗體，分別與合適粒徑大小的羧基化聚苯乙烯微球在緩沖液中混合，在活化劑的作用下，聚苯乙烯微球上的羧基與抗體上的氨基縮合形成偶聯物。4.如權利要求3所述的CRP單克隆抗體納米乳膠微球組合物，其特征是:所述CRP單克隆抗體是用人血清中C反應蛋白天然抗原免疫小鼠，篩選多個親和力不同的細胞株，優選互補配對的具有不同抗原識別表位的抗體亞型，其親和力在IXlO6 -1XlO8 M—1之間或以上。5.如權利要求3所述的CRP單克隆抗體納米乳膠微球組合物，其特征是:C反應蛋白單克隆抗體的不同種亞型，分別偶聯不同直徑的聚苯乙烯微球，或者以混合偶聯同一種直徑的聚苯乙烯微球。6.如權利要求3-5任一項所述的C...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王雷，李一凡，
申請(專利權)人：深圳伯美生物醫藥有限公司，
類型：發明
國別省市：
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