本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種原發(fā)性膽汁性肝硬化的特異性自身抗體和相應(yīng)抗原，所述特異性自身抗體是以膽管癌細(xì)胞RBE總蛋白作為抗原，利用免疫印跡法檢測原發(fā)性膽汁性肝硬化PBC患者血清，檢測到針對分子量約20kD蛋白的自身抗體，將其命名為Sp20抗體，然后利用雙向電泳從PBC患者血清中分離得到該Sp20抗體。本發(fā)明專利技術(shù)還提供該Sp20抗體在制備診斷原發(fā)性膽汁性肝硬化試劑盒中的應(yīng)用。通過研究Sp20抗體在PBC發(fā)病中的機制，為PBC患者早期診斷、早期治療及預(yù)后的判斷提供理論依據(jù)。有助于對AMA陰性的PBC患者的診斷，以及有助于與其它自身免疫病的鑒別診斷。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種原發(fā)性膽汁性肝硬化的特異性自身抗體、其相應(yīng)抗原和它們的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)是一種慢性、進(jìn)行性膽汁淤積性肝臟疾病，一般認(rèn)為與自身免疫有關(guān)。病變特點是以肝內(nèi)小膽管的非化膿性炎癥為特征。PBC在中老年女性中多見，男女比例為1:8。目前該病尚無治愈的方法，但早期及時治療能改善生化指標(biāo)及肝臟組織學(xué)病變，從而延緩病情進(jìn)展，一旦進(jìn)入晚期，則肝移植為唯一可行的治療手段，因此早診斷早治療至關(guān)重要。但因該病早期臨床表現(xiàn)不典型及臨床重視程度不夠、診斷水平等原因，近年來，該病在城市人口中有增高的趨勢。PBC的具體病因與發(fā)病機制仍不清楚，該病常合并其他器官自身免疫性疾病。在該病中幾乎所有患者均存在特異性自身抗體和自身反應(yīng)性T細(xì)胞反應(yīng)，因此被稱為是一種器官特異性的自身免疫性疾病。抗線粒體抗體(antimitochondrialautoantibodies, AMA)是該病的主要診斷指標(biāo)，但仍有部分患者該抗體陰性，極易誤診。因此，尋找PBC患者除ΑΜΑ、抗核抗體(antinuclearantibodies, ANA)以外一種新的自身抗體及其祀抗原，分析其在PBC患者中的臨床意義，探討其與PBC發(fā)病機制的關(guān)系，以期有助于PBC患者的早期診斷、早期治療以及預(yù)后的判斷。近年來國外研究發(fā)現(xiàn)在PBC中存在一種新的自身抗原成分，它可以共價的連接SplOO和PML蛋白，被稱為微小泛素相關(guān)的修飾因子(small ubiquitin-relatedmodifiers, SUMO)。SUM0-1和SUM0-2及SUM0-3蛋白是存在于其他核點蛋白中的特殊蛋白質(zhì)。它們能夠通過相似的泛素結(jié)合途徑，共價的連接到其他細(xì)胞蛋白上，但并不形成泛素化。SUMO結(jié)合的蛋白并不會導(dǎo)致其降解，而是穩(wěn)定的結(jié)合靶蛋白及調(diào)節(jié)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。有研究顯示，在99例抗SplO O和PML抗體陽性的PBC患者中可檢測到抗SuM0_2和SUM0-1抗體，其在PBC中的陽性率為42%和15%。但在抗核點抗體陰性的PBC患者中并沒有發(fā)現(xiàn)抗SUMO抗體，因此認(rèn)為抗SUMO抗體也是PBC的一種新型自身抗體類型。最近AlessandroGranito等首次報道Spl40是一種新的、高度特異的PBC自身抗原。對135例PBC患者和157例疾病對照組(自身免疫性肝炎、原發(fā)性硬化性膽管炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡)血清抗Spl40抗體進(jìn)行檢測陽性率為15% (20/135)，而在疾病對照組中未檢測到，由此可見，抗Spl40抗體是PBC高度特異的自身抗體。在AMA陰性的PBC患者中抗Spl40抗體的陽性率(53%)顯著高于AMA陽性的PBC患者(9%)。AMA是PBC診斷的重要血清學(xué)標(biāo)志，超過90%的PBC患者出現(xiàn)AMA，仍有10%PBC患者AMA為陰性；而抗gp210、抗LBR、抗P62、抗Sp 140抗體僅出現(xiàn)在少部分PBC患者，因此，尋找新的特異性的自身抗體對PBC患者的早期診斷有重要意義，有助于對AMA陰性的PBC患者的診斷，以及AMA陽性的PBC患者的診斷，同時特異性抗原的鑒定是研究PBC發(fā)病機制的條件之一，有助于與其它自身免疫病的鑒別診斷。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種原發(fā)性膽汁性肝硬化的特異性自身抗體、其相應(yīng)抗原和它們的應(yīng)用。為了實現(xiàn)本專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)的一種原發(fā)性膽汁性肝硬化的特異性自身抗體和相應(yīng)抗原，所述特異性自身抗體是以膽管癌細(xì)胞RBE總蛋白作為抗原，利用免疫印跡法檢測原發(fā)性膽汁性肝硬化PBC患者血清，檢測到針對分子量約20kD蛋白(即，相應(yīng)抗原)的自身抗體，將其命名為Sp20抗體，然后利用雙向電泳從PBC患者血清中分離得到該Sp20抗體。利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜法對Sp20進(jìn)行鑒定。間接免疫熒光法檢測抗Sp20抗體熒光模型，對結(jié)果進(jìn)行分析。對比抗Sp20抗體陽性與陰性PBC患者在臨床表現(xiàn)、生化免疫指標(biāo)、自身抗體、肝臟病理分期、對UDCA的治療反應(yīng)及預(yù)后進(jìn)行比較等方面指標(biāo)，分析抗Sp20抗體的臨床意義。本專利技術(shù)還提供上述的Sp20抗體在制備診斷原發(fā)性膽汁性肝硬化試劑盒中的應(yīng)用。本專利技術(shù)提供了一種新的PBC·特異性自身抗體，通過研究其在PBC發(fā)病中的機制，為PBC患者早期診斷、早期治療及預(yù)后的判斷提供理論依據(jù)。有助于對AMA陰性的PBC患者的診斷，以及有助于與其它自身免疫病的鑒別診斷。為臨床研發(fā)新的PBC診斷試劑提供科學(xué)依據(jù)。附圖說明圖1為本專利技術(shù)較佳實施例采用免疫印跡法檢測患者血清，1-8為PBC患者血清，9為SS患者血清，均出現(xiàn)針對分子量20kD蛋白的自身抗體，N為陰性對照血清。圖2為Sp20抗體陽性和陰性PBC患者I年至7年的平均生存概率的比較。圖3為Sp20抗體陽性和陰性PBC患者5年的生存率。圖4為以RBE細(xì)胞裂解液的細(xì)胞核、細(xì)胞漿、全細(xì)胞為抗原，以含有抗TOC-E2、抗Sp20的PBC患者血清為抗體利用免疫印跡法的檢測結(jié)果，I以全細(xì)胞為抗原；2以細(xì)胞漿為抗原；3以細(xì)胞核為抗原。其中74kD條帶對應(yīng)H)C-E2，20kD條帶對應(yīng)Sp20。圖5為Sp20在細(xì)胞核、細(xì)胞漿、全細(xì)胞中相對灰度值的比較。圖6為采用免疫印跡法檢測Sp20在來自人不同器官組織的細(xì)胞系、大鼠肝細(xì)胞及大腸桿菌中的分布，1-8分別為人肝癌細(xì)胞株H印G2. 2. 15、人宮頸癌細(xì)胞株HeLa、人乳腺癌細(xì)胞株Mcf-7、人黑色素瘤細(xì)胞株Mel-edl、人低分化胃腺癌細(xì)胞株BCG-823、人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NC1-H446、人膽管癌細(xì)胞株RBE及大鼠肝細(xì)胞株BRL，在以上細(xì)胞中均出現(xiàn)sp20 ；9為大腸桿菌E. col1. JM109。具體實施例方式以下實施例用于說明本專利技術(shù)，但不用來限制本專利技術(shù)的范圍。除非特殊說明，以下實施例中使用的試劑和材料均為市售商品。實施例1 Sp20自身抗體在PBC患者中的檢測一、病例選擇1. 35例PBC患者為來自北大人民醫(yī)院肝病科1995年至2004年的住院病人，其中女性34例，男性I例，年齡34-77歲，平均(54± 10)歲。對照組選擇慢性乙型肝炎患者8例，慢性丙型肝炎患者5例，干燥綜合征20例，自身免疫性肝炎8例，9例健康獻(xiàn)血者。干燥綜合征患者血清為北大人民醫(yī)院免疫科實驗室提供，健康獻(xiàn)血者血清為北大人民醫(yī)院血庫提供，原發(fā)性膽汁性肝硬化、慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎和自身免疫性肝炎患者血清由肝病科提供，研究所用的血清均_20°C保存。2.診斷標(biāo)準(zhǔn)PBC參考2000年AASLD (美國肝病學(xué)會)的診斷指南I)血清堿性磷酸酶水平等膽汁淤積的指標(biāo)升高；2)通過腹部B超或CT排除其他膽道梗阻因素；3)血清AMA或AMA-M2亞型陽性；4)AMA陰性患者則進(jìn)行肝臟組織學(xué)檢查，符合PBC的病理改變。干燥綜合征采用2002年歐洲-美國干燥綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)，自身免疫性肝炎診斷參照國際自身免疫性肝炎聯(lián)盟的診斷指標(biāo)。慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎診斷符合2000年全國傳染病及肝病年會所制定標(biāo)準(zhǔn)。3.肝臟病理學(xué)檢查共對32例PBC患者進(jìn)行肝臟病理檢查，肝組織常規(guī)石蠟包埋，HE及Masson染色，由同一位病理醫(yī)師閱片。組織學(xué)分期參照以下標(biāo)準(zhǔn)I期為僅限于匯管三角的膽管炎癥；II期為顯本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
一種原發(fā)性膽汁性肝硬化的特異性自身抗體和相應(yīng)抗原，其特征在于，所述特異性自身抗體是以膽管癌細(xì)胞RBE總蛋白作為抗原，利用免疫印跡法檢測原發(fā)性膽汁性肝硬化PBC患者血清，檢測到針對分子量20kD蛋白的自身抗體，將其命名為Sp20抗體，然后利用雙向電泳從PBC患者血清中分離得到該Sp20抗體。
【技術(shù)特征摘要】
2011.12.23 CN 201110439887.01.一種原發(fā)性膽汁性肝硬化的特異性自身抗體和相應(yīng)抗原，其特征在于，所述特異性自身抗體是以膽管癌細(xì)胞RBE總蛋白作為抗原，利用免疫印跡法檢測原發(fā)性膽汁性肝硬化PBC患者血清，檢測到針...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：魏來，張海瑩，王江華，
申請(專利權(quán))人：北京大學(xué)人民醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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