本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種在家蠶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人源化糖蛋白的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)座載體，該載體中包含一個(gè)GFP報(bào)告基因和/或一個(gè)Neomycin抗性篩選基因，還包含以下4個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因中的至少一個(gè)：GnT2、β4GalT、ST3和ST6。本發(fā)明專利技術(shù)還公開了含人源化糖基轉(zhuǎn)移酶基因的家蠶轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，將上述載體與Helper質(zhì)粒按照3：3：1的質(zhì)量比轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，通過G418篩選，形成細(xì)胞單克隆化的克隆島，再經(jīng)傳代培養(yǎng)，構(gòu)成轉(zhuǎn)基因家蠶細(xì)胞系。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及將PiggyBac轉(zhuǎn)座載體應(yīng)用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家蠶細(xì)胞系。具體地講,本專利技術(shù)涉及構(gòu)建一個(gè)用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家蠶細(xì)胞系的新型piggyBac轉(zhuǎn)座載體。該載體可用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因家蠶細(xì)胞系，并通過Bac-to-Bac系統(tǒng)表達(dá)人源化糖蛋白。該載體包括一個(gè)GFP的報(bào)告基因和/或一個(gè)Neomycin的抗性篩選基因，以及1_4個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因(GnT2，GalT,ST3, ST6)。
技術(shù)介紹
piggyBac (以前叫作IFP2)轉(zhuǎn)座子，是一個(gè)來源于鱗翅目昆蟲的DNA型轉(zhuǎn)座子，在結(jié)構(gòu)上與II型短的插入重復(fù)因子相關(guān)，在分類上屬于第二類型，這一類型的因子包括hobo、hermers、mariner、P、Tcl 和 AC 因子。piggyBac 轉(zhuǎn)座子最初是在桿狀病毒(Baculovirus)侵染 Trichoplusia ni 昆蟲 TN-368 細(xì)胞株系時(shí)，從 Galleria mellonella (GmMNPV)或Autographa californica (AcMNPV)核多角體病毒內(nèi)首次分離得到的。piggyBac轉(zhuǎn)座子是一個(gè)自主因子，長2476bp，含有一個(gè)RNA聚合酶II啟動(dòng)子區(qū)和一個(gè)聚腺苷酸信號，該信號的側(cè)面是一個(gè)可讀編碼框(0RF)，編碼I個(gè)單一的長約2.1kb的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，即I個(gè)68kD的轉(zhuǎn)座酶，該轉(zhuǎn)座酶是轉(zhuǎn)座子高頻率的切出和轉(zhuǎn)座所需的。piggyBac轉(zhuǎn)座子的末端是長13bp的反向重復(fù)序列(ITR),其內(nèi)側(cè)各有一段間隔區(qū)(spacer),但并不對稱(左端長3bp，右端長31bp)，再靠內(nèi)側(cè)是各長19bp的對稱的亞末端反向重復(fù)(STR)。piggyBac轉(zhuǎn)座子反向重復(fù)序列的5’末端以2_3個(gè)C堿基結(jié)束，3’末端的G堿基在切出位點(diǎn)的選擇過程中起作用。PiggyBac轉(zhuǎn)座子總是在TTAA目標(biāo)位點(diǎn)處插入，因而被歸納為TTAA-特殊的可轉(zhuǎn)移因子家族。 目前，piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)已成為在昆蟲中使用最廣的轉(zhuǎn)座子,它已被證明能夠在5個(gè)目(鱗翅目、雙翅目、膜翅目、鞘翅目和直翅目)的20多種昆蟲中轉(zhuǎn)座。piggyBac轉(zhuǎn)座主要用于昆蟲的轉(zhuǎn)基因研究，其攜帶的基因大多為可見的報(bào)告基因，如ZsGFP，DsRedl，EYFP等熒光標(biāo)記。它們受位置影響比較小，可以很方便地測試轉(zhuǎn)座效率。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問題是提供一種可用于家蠶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人源化糖蛋白的轉(zhuǎn)基因新型轉(zhuǎn)座載體及其制備方法。為了解決上述技術(shù)問題,本專利技術(shù)利用piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，將一個(gè)GFP的報(bào)告基因和/或一個(gè)Neomycin的抗性篩選基因，以及4個(gè)人源化糖基轉(zhuǎn)移酶基因(即GnT2、β 4GalT、ST3和ST6)，轉(zhuǎn)座至家蠶細(xì)胞基因組上以獲得一株新型的家蠶細(xì)胞系，并進(jìn)一步利用Bac-to-Bac系統(tǒng),在該新型細(xì)胞系內(nèi)表達(dá)人源化的糖蛋白。作為本專利技術(shù)的在家蠶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人源化糖蛋白的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)座載體的一種改進(jìn)該載體中包含一個(gè)GFP報(bào)告基因以及以下4個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因中的至少2個(gè)GnT2、β 4GalT、ST3 和 ST6。該載體的構(gòu)建方法為將GFP報(bào)告基因以及以下4個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因中的至少2個(gè)GnT2、β 4GalT、ST3和ST6分別通過酶切方式克隆進(jìn)pXL-BacII載體中。作為本專利技術(shù)的在家蠶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人源化糖蛋白的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)座載體的另一種改進(jìn)該載體包含一個(gè)Neomycin篩選基因以及以下4個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因中的至少2個(gè)GnT2、β 4GalT,ST3 和 ST6。該載體的構(gòu)建方法為將Neomycin篩選基因以及以下4個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因中的至少2個(gè)GnT2、β 4GalT、ST3和ST6分別通過酶切方式克隆進(jìn)pXL-BacII載體中。作為本專利技術(shù)建立轉(zhuǎn)基因家蠶細(xì)胞系的另一種改進(jìn)將上述構(gòu)建所得的兩種載體與Helper質(zhì)粒按按照3 :3 1的質(zhì)量比轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，通過G418篩選，形成細(xì)胞單克隆化的克隆島，再經(jīng)傳代培養(yǎng)，構(gòu)成轉(zhuǎn)基因家蠶細(xì)胞系。綜上所述,本專利技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)如下，構(gòu)建新型的piggyBac轉(zhuǎn)座載體，能應(yīng)用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家蠶細(xì)胞。該載體具有高效性和穩(wěn)定性，并且具有一個(gè)GFP的報(bào)告基因或一個(gè)Neomycin的抗性篩選基因,便于檢測和篩選?！渥⒄f明GnT2 (beta-1, 2_N_ 乙酸葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶，beta-1, 2-N_acetylglucosaminyltransferase),β 4GalT (beta-1, 4_ 半乳糖轉(zhuǎn)移酶，beta-1, 4-galactosy I transferase),ST3 (alpha-2, 3_ 唾液酸轉(zhuǎn)移酶 4, alpha-2, 3-sialyltransferase 4)，ST6 (alpha-2, 6_ 唾液酸轉(zhuǎn)移酶 I, alpha-2, 6-sialyltranferase I)。附圖說明下面結(jié)合附圖對本專利技術(shù)的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1 是 pXL-BacII_GalT/GFP/ST6 轉(zhuǎn)座載體示意圖；圖2 是 pXL-BacII_Neo/ST3/GnT2 轉(zhuǎn)座載體示意圖；圖3是轉(zhuǎn)座載體轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞后I天的熒光圖；圖4是細(xì)胞單克隆化后的克隆島圖；圖5是表達(dá)人源化糖蛋白的家香轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系圖；A :正常細(xì)胞，白光；B:正常細(xì)胞，熒光；C :轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，白光；D:轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，熒光。具體實(shí)施例方式本專利技術(shù)通過以下實(shí)施例作進(jìn)一步闡述。下述實(shí)施例中的通過酶切方式克隆可按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》告知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行操作。實(shí)施例1、pXL-BacII_GalT/GFP/ST6轉(zhuǎn)座載體的構(gòu)建1、β 4GalT、ST6、A3啟動(dòng)子、SV40PolyA終止子基因擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)根據(jù)已知的人的MGalT和ST6基因序列，通過Primer 5. O軟件設(shè)計(jì)引物(SEQID NO I 4)，根據(jù)pSL1180-A3質(zhì)粒和pSilencer 4. l-CMV-neo質(zhì)粒分別設(shè)計(jì)兩對引物擴(kuò)增 A3，一對引物擴(kuò)增 SV40PolyA (SEQ ID NO 3，4)。具體如下@4GalT基因擴(kuò)增引物序列β 4GalT-F CTAATTCAAGATGAGGCTTCGGGAGCCGCTCCβ 4GalT-R TCGAAATCTCCTAGCTCGGTGTCCCGATGTCCACTGST6基因擴(kuò)增引物序列ST6-F GCGGCCGCATGATTCACACCAACCTGST6-R CCGCGGTTAGCAGTGAATGGTCCGA3啟動(dòng)子基因擴(kuò)增引物序列A3-F CCGGAATTCTGCGCGTTACCATATATGGTGAA3-R GAAGCCTCATCTTGAATTAGTCTGCAAGAAAAG2、0 4GalT、ST6、A3 啟動(dòng)子、SV40PolyA 終止子基因克隆本實(shí)驗(yàn)中，大腸桿菌Escherichia coli TGl為本實(shí)驗(yàn)室保存,人胚肺成纖維細(xì)胞HFL-1購自上海中科院細(xì)胞庫，pSL1180-A3、pSL1180及pXL-BacII質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存，pSilencer 4. l-CMV-neo 質(zhì)粒購自 Applied Biosystems。以抽提得到的人胚肺成纖維細(xì)胞HFL-1細(xì)胞總RNA為模板，取1. 5 mL Eppendof管，加入總 RNA 4 μ g, oligo d(T) 18 primer I μ L本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
在家蠶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人源化糖蛋白的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)座載體，其特征是：該載體中包含一個(gè)GFP報(bào)告基因和/或一個(gè)Neomycin抗性篩選基因，還包含以下4個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因中的至少一個(gè)：?GnT2、β4GalT、ST3和ST6。
【技術(shù)特征摘要】
1.在家蠶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人源化糖蛋白的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)座載體，其特征是該載體中包含一個(gè)GFP報(bào)告基因和/或一個(gè)Neomycin抗性篩選基因，還包含以下4個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因中的至少一個(gè)GnT2、β 4GalT、ST3 和 ST6。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在家蠶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人源化糖蛋白的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)座載體，其特征是該載體中包含一個(gè)GFP報(bào)告基因以及以下4個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因中的至少2個(gè)GnT2、β 4GalT,ST3 和 ST6。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在家蠶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人源化糖蛋白的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)座載體，其特征是該載體包含一個(gè)Neomycin篩選基因以及以下4個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因中的至少2個(gè)GnT2、β 4GalT, ST3 和 ST6。4.如權(quán)利要求2所述的在家蠶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人源...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：繆云根，胡嘉彪，楊華軍，周芳，
申請(專利權(quán))人：浙江大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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