本發明專利技術公開了一種重組人促紅素-CTP融合蛋白的生產工藝方法，其特點是重組工程細胞株的培養方式采用微載體懸浮灌注培養技術或無血清懸浮流加培養技術。本發明專利技術還公開了重組人促紅素-CTP融合蛋白的純化工藝，通過優化，獲得簡單工藝流程，以獲得高純度、高活性的重組人促紅素-CTP融合蛋白。本發明專利技術還涉及重組人促紅素-CTP融合蛋白在猴體內的代謝動力學研究以及在治療大鼠腎性貧血上的應用。
【技術實現步驟摘要】
重組人促紅素-CTP融合蛋白生產工藝及應用
本專利技術屬于生物制藥工藝領域。其具體涉及一種重組人促紅素與人絨毛膜促性腺激素β亞基羧基末端肽的融合蛋白的一種生產工藝方法，包括該融合蛋白的重組工程細胞株的獲得、細胞培養及蛋白純化工藝方法以及重組人促紅素-CTP融合蛋白在猴藥代實驗和對大鼠腎性貧血治療上的應用。
技術介紹
EPO是一種主要由腎臟產生的糖蛋白，分子量約為35KD，是人體內調節紅系造血的主要激素，在紅系祖細胞的增殖、分化和成熟中起著重要的調控作用。目前我國對EPO需求量逐年遞增，但是普通EPO存在體內半衰期短，患者給藥次數頻繁等問題。因此如何延長其體內半衰期，以降低給藥頻次，成為當前EPO藥物的研究熱點。目前常用的技術手段有三種，一是使EPO進行PEG化(專利號200880021159. 4)，二是通過氨基酸突變增加糖化位點(美國安進公司的Aranesp，已上市)，三是使其與一些大分子蛋白或高糖化片段相連形成融合蛋白，目前已有文獻報道有EPO-FC (見專利申請號200880005733. 7)、EPO-HAS (見專利申請號 200410053319. 7)和 EP0-CTP 文獻報道(((Development of a Long-Acting Erythropoietin by Fusing the Carboxyl-Terminal Peptide of Human Chorionic Gonadotropin_-Subunit to the Coding Sequence of Human Erythropoietin)))等。本專利技術所述的融合蛋白是參考上述專利及文獻基礎設計的，在EPO的羧基末端增加一段帶有人絨毛膜促性腺激素β亞基的肽鏈。人絨毛膜促性腺激素(hCG)是胚胎滋養層細胞分泌的一類具有重要生理功能的糖蛋白激素，由兩個不同的亞基α、β以非共價鍵連接組成，CTP短肽是人絨毛膜促性腺激素β亞基羧基末端肽。人絨毛膜促性腺激素β亞基羧基末端肽能夠增加唾液酸含量，增加分子量，延長半衰期而不影響EPO蛋白活性，已有文獻 艮道(《Development of a Long-Acting Erythropoietin by Fusing the Carboxyl-Terminal Peptide of Human Chorionic Gonadotropin_-Subunit to the Coding Sequence of Human Erythropoietin)))支持其可使 EPO 半衰期延長 2-3 倍。由于EPO為高糖化蛋白，其分子量的40%為糖，融合CTP短肽后其糖基化程度更高，因此EPO-CTP融合蛋白的生產也必須選用糖化修飾較完善的哺乳動物細胞表達系統。 重組糖蛋白類藥物的生產目 前較成熟的生產表達系統為哺乳動物細胞表達系統，最常用的細胞系為中華倉鼠卵巢細胞(CHO)。目前哺乳動物細胞大規模培養方法可以分為貼壁培養、懸浮培養和固定化培養。貼壁培養是指細胞貼附在一定的固相表面進行單層培養。由于細胞固定于表面，不需要復雜的細胞截流裝置，便于采用灌注培養。懸浮培養是指細胞在反應器中自由懸浮生長的過程。懸浮培養系統主要適用于非貼壁依賴性細胞培養。固定化培養是將動物細胞與水不溶性載體結合起來，再進行培養的一種方法。本專利技術中EPO-CTP融合蛋白的生產可采用兩種細胞培養方式，即微載體貼附灌注培養和懸浮流加培養方式。其特點是采用剪切力小，傳氧效果好的，混合方式為搖動式混合的激流式細胞生物反應器。第一種培養方式采用微載體貼附懸浮灌注培養，微載體可支持細胞高密度、長時間生長，且微載體懸浮于培養液內，可實現較高的傳質傳氧效率，此種培養方式可不斷補充新鮮培養液、排出代謝廢物、延長細胞表達時間，并且利用懸浮培養營養物質、溶解氧混合均勻的特點，從而提高重組蛋白產量，為一種新型實用的生產高糖化重組蛋白的方法。第二種培養方式為懸浮流加培養，主要是用于可以通過懸浮馴化并適應懸浮培養的細胞。懸浮流加培養工藝操作簡單、可靠靈活，特別是利用激流式細胞生物反應器傳氧效果好，一次性反應袋操作方便，可大大縮短培養周期，易于放大培養規模，通過工藝的簡單控制，即可滿足EPO-CTP生產需求。本專利技術對利用此種生產方法生產的融合蛋白在動物體內的應用進行了研究，融合蛋白在食蟹猴體內的藥代實驗數據顯示出優于普通EPO的半衰期。在大鼠腎性貧血治療上，融合蛋白可達到一周給藥一次的長效作用。
技術實現思路
本專利技術所要解決的問題主要在于優化形成了一種重組人促紅素-CTP融合蛋白的生產工藝方法，包括生產重組人促紅素-CTP融合蛋白的重組工程細胞株的構建，并采用載體貼附灌注培養工藝或懸浮流加工藝及優化的蛋白分離純化方法獲得高活性、高純度融合蛋白，經實驗證明該融合蛋白在治療過程中可達到減少給藥頻率的效果。本專利技術公開了一種重組人促紅素與人絨毛膜促性腺激素β亞基羧基末端肽的融合蛋白的核甘酸序列及氨基酸序列。SEQ ID NO I 是 EP0-CTP 核甘酸序列CCG GAA iTC '丨 CCACC GGGGTGCACGAATGTCCTGCCTGGCTGTGGCTTCTCCTGTCCCTGCTGTCGCTCCCTCTGGGCCTCCCAGTCCTGGGCGCCCCACCACGCCTCATCTGTGACAGCCGAGTCCTGGAGAGGTACCT CTTGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAATATCACGACGGGCTGTGCTGAACACTGCAGCTTGAATGAGAATATCACTGTCCCAGACACCAAAGTTAATTTCTATGCCTGGAAGAGGATGGAGGTCGGGCAGCAGGCCGTAGAAGTCTGGCAGGGCCTGGCCCTGCTGTCGGAAGCTGTCCTGCGGGGCCAGGCCCTGTTGGTCAACTCTTCCCAGCCGTGGGAGCCCCTGCAGCTGCATGTGGATAAAGCCGTCAGTGGCCTTCGCAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTCTGGGAGCCCAGAAGGAAGCCATCTCCCCTCCAGATGCGGCCTCAGCTGCTCCACTCCGAACAATCACTGCTGACACTTTCCGCAAACTCTTCCGAGTCTACTCCAATTTCCTCCGGGGAAAGCTGAAGCTGTACACAGGGGAGGCCTGCAGGACAGGGGACAGATCTTCCTCTTCAAAGGCCCCTCCACCTAGCCTTCCATCTCCATCTCGACTCCCTGGGCCTTCTGACACCCCTATCCTCCCACAA |tgataa|( ja;C/C X 'Ge AAAAGGAAAA(方框為起始密碼子和終止密碼子；陰影斜體為EcoRI和Not I酶切位點)SEQ ID NO 2 是 EP0-CTP 氨基酸序列MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVP DTKVNFYAffKRMEVGQQAVEVffQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDK本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種重組人促紅素?CTP融合蛋白的生產工藝方法，其具體步驟包括：將含有編碼重組人促紅素?CTP融合蛋白基因的表達載體，采用適當的轉化方法轉化宿主細胞，通過優化篩選獲得重組工程細胞株，并采用微載體懸浮灌注或無血清懸浮流加培養工藝方法進行細胞培養并收獲細胞培養液，通過經過優化的純化工藝流程來分離獲得高純度、高活性的重組人促紅素?CTP融合蛋白。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：王銳，張秀芹，孟慶勇，董敏，劉鐵成，梁秋波，李會成，
申請(專利權)人：哈藥集團技術中心，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。