本發明專利技術涉及一種PH梯度磷酸鈣共沉淀轉染試劑盒，提供了PH梯度的HBS緩沖液組合。在首次實驗中，實驗者可以通過做平行實驗，選出最佳PH的HBS緩沖液，作為以后實驗的參考。由于PH梯度HBS緩沖液組合的存在，當發現某一條件轉染效率不理想的時候，便可以重新通過平行實驗來摸索條件。細胞轉染過程中，轉染復合物溶液的加入是會對細胞產生毒性的。該試劑盒中提供的臺盼藍溶液便于使用者在實驗過程中實時評價加入轉染復合物對細胞的毒性，從而增多或者降低轉染復合的加入，最終總結出適合該實驗室的某種細胞系的最佳轉染條件。本發明專利技術的優點如下：(1)提供了不同PH值的HBS緩沖溶液，便于探索最佳轉染條件；(2)可以在轉染的同時監測細胞的生長狀況；(3)提供了在不同物種細胞系中表達的對照質粒，滿足了不同實驗室的檢測需求。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種綜合改進型的磷酸鈣沉淀轉染試劑盒，試劑盒所包含的成分主要有無菌水(組織培養級別)，PH梯度的HBS緩沖溶液組合，2M的氯化鈣。磷酸鈣沉淀介導的細胞轉染是一種傳統的細胞轉染方法。近些年來出現了很多類型的細胞轉染試劑，并且它們在不同物種的細胞系中表現出了高效的轉染效率。盡管如此，傳統的磷酸鈣沉淀法并沒有被淘汰，依然是很多生物實驗室的轉染首選。主要是由于磷酸鈣沉淀法有著用途廣泛，成本低廉等優點。磷酸鈣沉淀轉染法成功的關鍵是磷酸鈣-DNA沉淀復合物的形成。而該復合物的形成又很大程度的依賴于HBS緩沖溶液的PH值。PH值的微小變化都會影響到轉染效率。目前國內的很多生物公司都推出了自己的磷酸鈣沉淀轉染試劑盒，然而試劑盒中的HBS緩沖液PH值是固定的。由于各個實驗室間存在著條件的差異，不可避免的導致其在某些實驗室可用，而換了其他實驗室便不好用。本專利技術很好的解決了這個問題。通過提供PH梯度的HBS緩沖液組合，可以使用戶在實驗的時候找到最佳的轉染條件，一旦條件找到，便可長期使用該條件進行細胞的高效轉染。同時該試劑盒中還提供了 O. 4%的臺盼藍溶液，用于監測轉染過程中的細胞死亡情況，便于找到轉染效率與存活率都可觀的最優的轉染條件。·
技術介紹
磷酸鈣沉淀細胞轉染法主要是通過形成磷酸鈣DNA沉淀復合物來達到將DNA輸送到體外培養細胞中的目的。普遍認為該方法可以促進DNA在細胞表面的附著，進而通過細胞的內吞作用將外源DNA攝入。該方法被常規的用來進行哺乳類細胞或昆蟲類細胞的瞬時轉染以及穩定轉染。DNA首先與氯化鈣混合，然后將該溶液逐滴的加入一種磷酸緩沖溶液中，從而形成DNA-磷酸鈣沉淀。在滴加DNA溶液的過程中，不斷地在混合液中吹打對最適沉淀的形成是很重的，因為成團聚集的DNA是不利于粘附甚至進入細胞的。除此之外，緩沖液的PH對于沉淀的形成也是至關重要的。找到形成最適沉淀的緩沖液的PH值對于各個獨立的實驗者來說是細胞轉染實驗成敗的關鍵。PH梯度磷酸鈣共沉淀轉染試劑盒，提供了 PH梯度的HBS緩沖液組合。在首次實驗中，實驗者可以通過做平行實驗，選出最佳PH的HBS緩沖液，作為以后實驗的參考。由于PH梯度HBS緩沖液組合的存在，當發現某一條件轉染效率不理想的時候，便可以重新通過平行實驗來摸索條件。細胞轉染過程中，轉染復合物溶液的加入是會對細胞產生毒性的。該試劑盒中提供的臺盼藍溶液便于使用者在實驗過程中實時評價加入轉染復合物對細胞的毒性，從而增多或者降低轉染復合的加入，最終總結出適合該實驗室的某種細胞系的最佳轉染條件。
技術實現思路
本專利技術的要點在于選擇如下配方無菌水(組織培養級別)100ml，2 XHBS緩沖液(7種PH) 100ml，2M氯化鈣15ml, O. 4%臺盼藍50ml，對照質粒IOOugo7個PH梯度的2 X HBS緩沖液是該專利技術的核心。2 X HBS緩沖液各成分濃度如下4-輕乙基哌嗪乙磺酸(50mM/L),氯化鉀(10mM/L)，葡萄糖(12mM/L)，氯化鈉(280mM/L)，磷酸鈉(I.5mM/L)。PH值分別是7. 01，7. 03，7. 05，7. 07，7. 10,7. 15，7. 2。配制完成后過濾除菌冷凍儲存。2M氯化鈣配制完成后過濾除菌冷凍儲存。O. 4%臺盼藍可以用來顯示細胞的死活。死細胞的細胞膜通透性增加使該染料可以進入到細胞內將細胞染成藍色。 對照質粒分別提供了可以在哺乳類細胞表達的綠色熒光蛋白重組質粒和可以在昆蟲細胞表達的綠色熒光蛋白重組質粒。滿足對于不同細胞系的檢測需求。本專利技術的優點如下(I)提供了不同PH值的HBS緩沖溶液，便于探索最佳轉染條件；(2)可以在轉染的同時監測細胞的生長狀況；(3)提供了在不同物種細胞系中表達的對照質粒，滿足了不同實驗室的檢測需求。具體實施方式下面結合實施例對本專利技術作進一步的詳細說明以60mm的培養皿培養貼壁細胞為例第一天準備用來轉染的細胞。按合適的濃度將細胞接種于60_細胞培養板。在37攝氏度CO2培養箱(哺乳類細胞)或25攝氏度培養箱(某些昆蟲細胞)中培養過夜。使細胞在轉染時的匯集度達到60% -90%為宜。第二天轉染細胞。制備轉染復合物I.取出一個EP管，標上A。加入18ul 2M的氯化鈣和IOug對照質粒，加水定容到150ul。2.取出一個EP管，標上B。加入150ul 2 X HBS緩沖液。(不同PH的HBS做平行試驗)3.將A溶液逐滴加入B溶液中，其間用渦旋震蕩儀震蕩促進DNA-磷酸鈣沉淀的形成。4.將混合液在室溫放置半小時。5.將混合液逐滴加入培養的細胞中。6. 37攝氏度CO2培養箱(哺乳類細胞)或25攝氏度培養箱(某些昆蟲細胞)中培養過夜。第三天換培養基以及細胞毒性的檢測。I.通過胰蛋白酶處理或將細胞吹打懸浮，取部分細胞進行稀釋，然后加入O. 4%的臺盼藍使其終濃度為O. 04%。血細胞板下計數評價細胞的存活情況。2.將剩下的細胞離心，移除含有轉染復合物的舊培養基。3.加入新鮮培養基，將細胞懸浮，重新接種培養。24-48小時后通過熒光觀察計算轉染效率，確定出最佳轉染條件。權利要求1 .本專利技術涉及一種PH梯度磷酸鈣共沉淀轉染試劑盒，其特征在于具有如下的組成無菌水(組織培養級別)IOOml ,2 X HBS緩沖液(7種PH) 100ml，2M氯化鈣15ml，O. 4 %臺盼藍50ml,對照質粒lOOug。全文摘要本專利技術涉及一種PH梯度磷酸鈣共沉淀轉染試劑盒，提供了PH梯度的HBS緩沖液組合。在首次實驗中，實驗者可以通過做平行實驗，選出最佳PH的HBS緩沖液，作為以后實驗的參考。由于PH梯度HBS緩沖液組合的存在，當發現某一條件轉染效率不理想的時候，便可以重新通過平行實驗來摸索條件。細胞轉染過程中，轉染復合物溶液的加入是會對細胞產生毒性的。該試劑盒中提供的臺盼藍溶液便于使用者在實驗過程中實時評價加入轉染復合物對細胞的毒性，從而增多或者降低轉染復合的加入，最終總結出適合該實驗室的某種細胞系的最佳轉染條件。本專利技術的優點如下(1)提供了不同PH值的HBS緩沖溶液，便于探索最佳轉染條件；(2)可以在轉染的同時監測細胞的生長狀況；(3)提供了在不同物種細胞系中表達的對照質粒，滿足了不同實驗室的檢測需求。文檔編號C12N15/85GK102952824SQ20111025193公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月30日 優先權日2011年8月30日專利技術者曲奕, 張洪濤 申請人:曲奕, 張洪濤本文檔來自技高網...
【技術保護點】
本專利技術涉及一種PH梯度磷酸鈣共沉淀轉染試劑盒，其特征在于具有如下的組成：無菌水(組織培養級別)100ml，2?X?HBS緩沖液(7種PH)100ml，2M氯化鈣15ml，0.4％臺盼藍50ml，對照質粒100ug。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：曲奕，張洪濤，
申請(專利權)人：曲奕，張洪濤，
類型：發明
國別省市：
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