共表達兩個獨立的抗關節炎分子TNFR-Fc和CTLA4-FasL的重組腺相關病毒載體及其構建方法與應用技術

本發明專利技術公開了共表達兩個獨立的抗關節炎分子TNFR-Fc和CTLA4-FasL的重組腺相關病毒載體及其構建方法與應用,將Furin裂解位點和FMDV2A自剪切肽聯合運用，使得兩個抗關節炎融合蛋白TNFR-Fc和CTLA4-FasL在同一重組腺相關病毒（AAV2）載體上于體外和體內均獲得了獨立共表達，并發揮各自的生物活性。實驗證明，含有本發明專利技術重組腺相關病毒載體的重組子介導表達的TNFR-Fc和CTLA4-FasL蛋白具有與母本蛋白相同的生物活性,含有TNFR-Fc和CTLA4-FasL雙融合分子的重組腺病毒載體比表達單分子的重組腺病毒載體能更有效地抑制關節炎的發展，表明其可在制備預防和治療關節炎（特別是類風濕性關節炎）藥物中應用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物
，具體涉及一種重組腺相關病毒載體，特別是涉及一種共表達兩個獨立的抗關節炎分子TNFR-Fc和CTLA4-FasL的重組腺相關病毒載體及其構建方法與其在制備預防和治療關節炎(特別是類風濕性關節炎)藥物中的應用。
技術介紹
類風濕性關節炎(RA)是一種主要累及關節的慢性自身免疫病，其特征為炎性細胞浸潤和滑膜增生，導致關節軟骨和骨破壞。RA發病機制復雜，許多因素參與其中，包括關鍵的促炎細胞因子TNFa和T淋巴細胞，二者被認為在RA進程中發揮重要作用。生物治療尤其是TNF抑制劑已經在RA臨床治療中取得了巨大成功，包括p75TNFR-Fc融合蛋白，然而，仍然有相當一部分病人對此種治療無效，因此迫切需要其它輔助或協同治療方法。此外，鑒于RA發病機制的復雜性，聯合阻斷不同致病因素已成為很有吸引力的治療策略，尤其是以T淋巴細胞為靶聯合TNF α抑制。一些動物研究提示，聯合阻斷T淋巴細胞和TNF α，很可能比單獨阻斷TNF α能更有效地治療RA。因此，TNF α抑制劑TNFR-Fc和T淋巴細胞抑制劑CTLA4-FasL的聯合應用具有一定發展前景。T淋巴細胞在類風濕性關節炎(RA)發病的起始和進展過程中都發揮關鍵作用，在RA患者的關節腔和滑膜中均可觀察到大量浸潤的T淋巴細胞，因此清除T淋巴細胞成為RA治療的一種有效策略。C TLA4-FasL融合分子將CTLA4胞外區和FasL胞外區融合在一起，一方面通過CTLA4功能域阻斷T淋巴細胞激活的共刺激信號，另一方面通過FasL功能域誘導活化T淋巴細胞凋亡，從而通過共刺激阻斷和凋亡誘導發揮對T淋巴細胞的雙重抑制作用。在前期研究中，首先證明腺相關病毒(Adeno-associated virus, AAV)介導的CTLA4_FasL基因轉移能夠有效抑制大鼠佐劑誘導性關節炎(AIA，一種T淋巴細胞依賴的RA動物模型)，并明顯減少關節中T淋巴細胞浸潤，進一步研究表明CTLA4-FasL比單獨FasL分子能更有效地阻止關節炎的發展。以往的抗TNFa和抗T淋巴細胞聯合治療研究，應用的都是抗TNF α抗體和抗⑶3或CD4抗體。鑒于高循環水平治療蛋白在人體內產生的副作用，使用抗體或者蛋白進行聯合治療并不利于今后的臨床應用，例如，使用etanercept (抗TNF α蛋白)和anakinra (抗IL-1抗體)會增加嚴重感染的風險。此外，包括TNFa抗體在內的重組蛋白體內半衰期比較短，需要反復注射，費用昂貴。因此使用雙抗體或蛋白聯合治療RA并不是理想的策略。內部核糖體進入位點(internal ibosome entry site, IRES)是小RNA病毒類中5’端非翻譯區中的一段序列，其二級結構和三級結構構成了蛋白質翻譯過程中核糖體的登陸平臺，40s核糖體亞單位可以不依賴5’端帽子結構而在內部結合到mRNA上，從而直接對其后的結構基因進行翻譯。IRES的這一特點可應用于構建同時表達兩個基因的雙順反子真核表達載體。IRES是一個傳統的介導雙基因表達原件，但是由于其存在一些缺陷嚴重影響了其在多順反子載體構建中的應用，主要有(I)轉錄起始效率較低，通常造成下游基因明顯低表達，IRES介導的上、下游基因表達量不平衡，通常下游基因的表達量僅是上游的20% -50% ； (2) IRES自身結構較大，其應用常受到載體容量的限制。Furin裂解位點和2A自剪切序列作為一種新的技術方法，已被用于在單一開放閱讀框中平衡共表達抗體重鏈和輕鏈。2A自剪切序列是由24個氨基酸組成的多肽，在最后兩個氨基酸處完成自剪切，可介導上游基因和下游基因表達比例均衡，此外，2A序列肽不會引發體內特異的免疫反應。由于2A自剪切發生在2A肽C末端兩個氨基酸殘基之間，使得上游蛋白攜帶23個殘留的2A肽段氨基酸，后者可能會影響上游蛋白的活性。為了消除殘留的2A肽段可能產生的副影響，Furin裂解位點(RAKR)被引入到2A序列的上游，以去除殘留的2A氨基酸。Furin是一種廣泛存在于所有脊椎動物細胞的跨膜酶，可有效加工前體蛋白，它在許多細胞事件中發揮催化作用，并在許多疾病和感染中發揮作用。成功的基因治療需要安全高效、穩定、持久表達的轉基因載體。非病毒載體具有安全性高、容量大和易制備等優點，可能具有較好的應用前景，但其基因轉染效率尚有待提高。盡管有多種病毒載體，如腺病毒、逆轉錄病毒和慢病毒等能導致外源基因高效轉染與表達，然而其表現出的肝臟毒性、致炎性、免疫原性和潛在的致瘤性引起國內外學者對其安全性的深切擔憂。腺相關病毒(AAV)屬于微小病毒科依賴病毒屬,是一種對人和動物不致病的單鏈脫氧核糖核酸病毒。將腺相關病毒自身的編碼基因去除，僅保留基因組兩末端的反向末端重復序列(ITR)，使其能裝載治療基因及表達元件而產生重組腺相關病毒(rAAV)。腺相關病毒可感染多種組織細胞，能穩定、持久地表達外源基因。腺相關病毒載體理化性質穩定，是目前基因治療所使用的各種載體中最具優勢和前途的載體之一。傳統制備重組腺相關病毒是采用腺病毒輔助的轉染方法，然而腺病毒污染的問題是其應用的障礙。尋找新的、更安全的制備方法可以使腺相關病毒載體進一步推廣應用。局部基因治療是一種具有吸引力的全身蛋白遞送的替代方法。在病毒基因遞送載體中，AAV似乎是最有希望用于臨床治療的一類 載體，而AAV2在動物研究中被應用的最多。AAV2 (腺相關病毒2型)可介導目的基因在體內長期表達，而且尚未發現由它直接引起的副作用，此外，關節中大多數細胞包括滑膜細胞和軟骨細胞等均可被AAV2轉導，而且AAV2似乎更傾向于轉導炎性細胞，這些特點使得AAV2成為基因治療RA的一個理想工具。AAV2介導的關節內基因轉移已被證實是一種在關節局部高水平表達治療蛋白從而阻止蛋白全身分布及副作用的有效策略。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種共表達兩個獨立的抗關節炎分子TNFR-Fc和CTLA4-FasL，且表達量平衡的重組腺相關病毒載體。本專利技術所提供的共表達兩個獨立的抗關節炎分子TNFR-Fc和CTLA4_FasL的重組腺相關病毒載體，是自上游至下游依次攜帶有TNFR-Fc基因、Furin裂解位點編碼序列、2A自剪切肽編碼序列和CTLA4-FasL基因的重組腺相關病毒載體。用于構建上述重組腺相關病毒載體的出發載體為pAAV2_neo、pAAV2neo_EFl α、pAAV2neo-HRE 或 pSDAVneo-CAG 等 AAV2 型載體，優選為 pAAV2_neo，所述 TNFR-Fc 基因、Furin裂解位點編碼序列、2A自剪切肽編碼序列和CTLA4_FasL基因位于載體pAAV2_neo中CMV啟動子和BGH polyA尾兩端的反向末端重復序列(ITR)之間。所述共表達兩個獨立的抗關節炎分子TNFR-Fc和CTLA4_FasL的重組腺相關病毒載體為TFCF，其核苷酸序列如序列表中序列5所示。本專利技術的另一個目的是提供一種構建上述共表達兩個獨立的抗關節炎分子TNFR-Fc和CTLA4-FasL的重組腺相關病毒載體的方法，可包括以下步驟I)合成編碼人 p75TNFR 胞外區(NCBI Genebank No. ΝΜ_001066· 2)的基因，在合成的人P75TNFR胞外區本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種共表達兩個獨立的抗關節炎分子TNFR?Fc和CTLA4?FasL的重組腺相關病毒載體，是自上游至下游依次攜帶有TNFR?Fc基因、Furin裂解位點編碼序列、2A自剪切肽編碼序列和CTLA4?FasL基因的重組腺相關病毒載體。

【技術特征摘要】
1.一種共表達兩個獨立的抗關節炎分子TNFR-Fc和CTLA4-FasL的重組腺相關病毒載體，是自上游至下游依次攜帶有TNFR-Fc基因、Furin裂解位點編碼序列、2A自剪切肽編碼序列和CTLA4-FasL基因的重組腺相關病毒載體。2.根據權利要求1所述的重組腺相關病毒載體，其特征在于用于構建上述重組腺相關病毒載體的出發載體為 pAAV2-neo、pAAV2neo_EFl α、pAAV2neo_HRE 或 pSDAVneo-CAG 等 AAV2型載體，優選為pAAV2-neo，所述TNFR-Fc基因、Furin裂解位點編碼序列、2A自剪切肽編碼序列和CTLA4-FasL基因位于載體pAAV2_neo中CMV啟動子和BGH polyA尾兩端的反向末端重復序列(ITR)之間。3.根據權利要求2所述的重組腺相關病毒載體，其特征在于所述共表達兩個獨立的抗關節炎分子TNFR-Fc和CTLA4-FasL的重組腺相關病毒載體為TFCF，其核苷酸序列如序列表中序列5所示。4.一種構建權利要求3所述共表達兩個獨立的抗關節炎分子TNFR-Fc和CTLA4_FasL 的重組腺相關病毒載體的方法，包括以下步驟1)合成編碼人P75TNFR胞外區(NCBIGenebank No. ΝΜ_001066· 2)的基因，在合成的人p75TNFR胞外區基因中自5’端至3’端依次包含有限制性內切酶Kpn I識別位點、Kozak 序列、起始密碼ATG、TNFR的原始信號肽、人P75TNFR胞外區基因、限制性內切酶Asc I和 Pac I識別位點、終止密碼子TGA和限制性內切酶EcoR I識別位點，在引入Asc I和Pac I識別位點時為了下游基因的正確編碼，在Asc I識別位點后加了一個額外的堿基Α、在 Pac I識別位點后加了一個額外的堿基G，將此合成的人p75TNFR胞外區基因命名為(KpnI) Kozak-ATG-s ignal-TNFR(Asc1-PacI) -TGA(EcoRI),其核苷酸序列如序列表中序列 I 所不， 將該基因克隆入載體PGEM-T中；2)合成編碼IgGlFc(NCBI GenBank:AJ294730.1)的基因，在合成的IgGlFc基因中自 5’端至3’端依次包含有限制性內切酶Asc I識別位點、IgGlFc基因、6XHis標簽和限制性內切酶Pac I識別位點，并在Asc I識別位點后加一個額外的堿基A，在Pac I識別位點后加了一個額外的堿基G，將此合成的IgGlFc基因命名為(AscI) IgGlFc-His(PacI),其核苷酸序列如序列表中序列2所示，將該基因克隆入載體pGEM-T中；3)用限制性內切酶KpnI和EcoR I將步驟I)合成的人p75TNFR胞外區基因(KpnI) Kozak-ATG-signal-TNFR(Asc1-PacI)-TGA (EcoRI)從載體 pGEM-T 上切下，將其連接入同樣經Kpn I和EcoR I雙酶切的載體pAAV2_neo中，得到攜帶人p75TNFR胞外區基因的重組載體PAAV2/TNFR，然后用限制性內切酶Asc I和Pac I將步驟2)合成的IgGlFc基因(AscI)IgGlFc-His(PacI)從載體pGEM-T上切下，將其連接入同...

【專利技術屬性】
技術研發人員：于繼云，張巍，王芳，閻瑾琦，王博，張曉郡，徐元基，
申請(專利權)人：中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所，
類型：發明
國別省市：