本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因沉默細(xì)胞模型的建立方法，選擇最有效RNA干涉靶序列，在體外合成兩段互補(bǔ)的寡核苷酸，利用載體上的BamH?Ⅰ和Cla?Ⅰ酶切位點，將Fut8基因siRNA片段重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pSINsi-hU6中。經(jīng)293T細(xì)胞包裝后，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度可達(dá)2.1×105CFU/ml，產(chǎn)生的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染前B細(xì)胞株通過400-1000ug/ml?G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)株。用Real?time-PCR及高效液相色譜（HPLC）檢測結(jié)果表明，F(xiàn)ut8siRNA復(fù)制缺陷型重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染70Z/3細(xì)胞中，F(xiàn)ut8mRNA及酶活性顯著下降。本發(fā)明專利技術(shù)具有操作簡單，基因沉默效率高、重復(fù)性好等優(yōu)點。Fut8基因沉默細(xì)胞模型的建立為Fut8基因生物學(xué)功能研究奠定了基礎(chǔ)。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種生物學(xué)功能研究領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因沉默細(xì)胞模型建立方法。
技術(shù)介紹
核心巖藻糖基化是普遍的蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程。FutS是修飾核心巖藻糖基化的唯一的糖基轉(zhuǎn)移酶(如圖8所示)，能夠調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，如分子間相互作用、細(xì)胞與細(xì)胞間的相互識別、蛋白質(zhì)的正確定位、細(xì)胞信號傳導(dǎo)等。FutS+小鼠有肺氣腫表現(xiàn)型，這是因為轉(zhuǎn)化生長因子I受體上的核心巖藻糖基缺損則降低TGF I與受體的結(jié)合能力，激活基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的表達(dá)，引起肺氣腫病變；Fut8基因敲除導(dǎo)致細(xì)胞表面的血管內(nèi)皮生長因子受體表達(dá)量下降。另外，Stubbs等發(fā)現(xiàn)核心巖藻糖基化程度能影響糖蛋白分子上的N-糖鏈的分子構(gòu)象和柔軟性。目前常用的方法是利用RNA干擾(RNA interference, RNAi)或基因敲除方法，抑制該基因表達(dá)，觀察相應(yīng)功能的丟失。基因敲除方法既費(fèi)時間又需要尖端實驗設(shè)備。RNA i發(fā)現(xiàn)為人們提供了特異性阻斷基因表達(dá)的新策略。RNA i通過在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染與靶基因相同序列的2Ibp的雙鏈RNA，即可使靶基因降解，而且具有特異性強(qiáng)、抑制效率高等特點。目前常用的siRNA導(dǎo)入方法是利用脂質(zhì)體導(dǎo)入雙鏈siRNA或含有siRNA序列的載體，但是上述方法存在siRNA進(jìn)入細(xì)胞后容易被降解、在細(xì)胞內(nèi)的效應(yīng)持續(xù)時間短、siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染效率低等問題。針對這種情況，目前應(yīng)用較多的是逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、脂質(zhì)體等載體。目前，有關(guān)一種核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因沉默細(xì)胞模型建立方法的文章及專利如下(I)用于失活a -1，6巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT8)基因表達(dá)的方法和組合物(專利公開號CN101883850A) (2) Methods and compositions for inactivating alphaI, 6fucosy I transferase (FUT8) gene expression (專利公開號=US2OO9(M225C) (Al))(3) Compositon for suppressing the expression of fucosyltransferase (專利公開號US2009221065(A1))(4) Wang X, Inoue S, Gu J, et al. Dysregulation of TGF-betalreceptoractivation leads to abnormal lung development and emphysema-1 ike phenotype incore fucose-deficient mice. Proc Natl Acad Sci USA. 2005, 102 (44):15791-6.(5)Stubbs HJ et al.1nfluence of core fucosylation on the flexibility ofa biantennary N-1inked oligosaccharide. Biochemistry 1996, 35:937-947.專利1-3專利技術(shù)使用包含鋅指蛋白和切割結(jié)構(gòu)域或切割半結(jié)構(gòu)域的融合蛋白來失活FUT8基因的方法和組合物。還提供了編碼所述融合蛋白的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸和融合蛋白的細(xì)胞。文章4介紹轉(zhuǎn)化生長因子I受體上的核心巖藻糖基缺損則降低TGFl與受體的結(jié)合能力，激活基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的表達(dá)，引起肺氣腫病變。文章5介紹核心巖藻糖基化程度能影響糖蛋白分子上的N-糖鏈的分子構(gòu)象和柔軟性。目前，F(xiàn)ut8siRNA復(fù)制缺陷型重組逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建Fut8基因沉默細(xì)胞模型的研究尚無報道。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)利用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建了 PSINs1-hU6-Fut8siRNA載體，克服了傳統(tǒng)載體的諸多弊端，以穩(wěn)定表達(dá)Fut8siRNA，通過細(xì)胞感染的方式快速建立Fut8基因沉默細(xì)胞模型，旨在為Fut8基因生物學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)。為了達(dá)到上述目的，本專利技術(shù)一種核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因沉默細(xì)胞模型的建立方法，包括如下步驟Stepl、根據(jù)Fut8基因序列，設(shè)計I條21個核苷酸雙鏈Fut8siRNA序列CUGAUCACU CCAGCAGAGA (759-778)；并設(shè)計Fut8siRNA雙鏈短發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA-sense:5 ' -GATCCACTGATCACTCCAGCAGAGATTCAAGAGATCTCTGCTGGAGTGATCAGTTTTTTAT-3';siRNA-antisense:5' -CGATAAAAAAACTGATCACTCCAGCAGAGATCTCTTGAACTCTGCTGGAGTGATCAGTG-3'Step 2、將該條Fut8siRNA片段重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pSINsi_hU6中，構(gòu)建pSINs1-hU6-Fut8siRNA 載體；Step 3、FutS基因沉默細(xì)胞模型的建立，包括如下分步Step 31、用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將 pSINs1-hU6_Fut8siRNA, pE-ampho 載體，pGP 載體共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝攜帶有PSINs1-hU6-Fut8siRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒；Step 32、將 3-5X IO4祀細(xì)胞進(jìn)行 9_12h 培養(yǎng),利用 7-lOug/mL polybrane 孵育后，通過病毒感染方式將Fut8siRNA轉(zhuǎn)染至靶細(xì)胞內(nèi)；Step 33、用400-1000ug/ml G418進(jìn)行篩選，并挑取單個細(xì)胞，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定的Fut8基因沉默細(xì)胞模型。優(yōu)選方式下，Step31 中的的脂質(zhì)體與 pSINs1-hU6_Fut8siRNA、pE-ampho 載體、PGP載體的摩爾濃度比例為4-5 :1. 5-2 1-1. 5 1-1. 5 ；Step 32中病毒液與細(xì)胞培養(yǎng)液之間的比例為1-2:10。本專利技術(shù)還提供了上述核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因沉默細(xì)胞模型的檢測方法，選用實時定量PCR鑒定，其中，所述實時定量PCR的引物序列為sense:AACAGCTTGTTAAGGCCAAAG, antisense:GCATGTCTTTGGAGTTCATTTC。本專利技術(shù)還提供了上述核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因沉默細(xì)胞模型酶活性的檢測方法，利用HPLC法測定Fut8酶活性，細(xì)胞裂解液蛋白含量為0. 2-0. 5mg,反應(yīng)時間為2_5小時。本專利技術(shù)在4種優(yōu)先設(shè)計的FutS基因RNA干涉靶序列中選擇最有效RNA干涉靶序列。根據(jù)該序列在體外合成兩段互補(bǔ)的寡核苷酸，利用載體上的BamH I和Cla I酶切位點，將Fut8基因siRNA片段重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pSINs1-hU6中。經(jīng)293T細(xì)胞包裝后，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度可達(dá)2. lX105CFU/ml,產(chǎn)生的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染前B細(xì)胞株(70Z/3細(xì)胞)，通過400-1000ug/ml G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)株，命名為Fut8-KD-70Z/3。用Realtime-PCR及高效液相色譜(HPLC)檢測結(jié)果表明，F(xiàn)ut8siRNA復(fù)制缺陷型重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染70Z/3細(xì)胞中，F(xiàn)utSmRNA及酶活性顯著下降。該專利技術(shù)具有操作簡單，基因沉默效率高、重復(fù)性好等優(yōu)點。Fut8基因沉默細(xì)胞模型的建立為Fut8基因生物學(xué)功能研本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
一種核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因沉默細(xì)胞模型的建立方法，其特征在于，包括如下步驟：S1、根據(jù)Fut8基因序列，設(shè)計1條21個核苷酸雙鏈Fut8siRNA序列：CUGAUCACU?CCAGCAGAGA（759?778）；并設(shè)計Fut8siRNA雙鏈短發(fā)夾結(jié)構(gòu)：siRNA?sense:5′?GATCCACTGATCACTCCAGCAGAGATTCAAGAGATCTCTGCTGGAGTGATCAGTTTTTTAT?3′;siRNA?antisense:5′?CGATAAAAAAACTGATCACTCCAGCAGAGATCTCTTGAACTCTGCTGGAGTGATCAGTG?3′S2、將該條Fut8siRNA片段重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pSINsi?hU6中，構(gòu)建pSINsi?hU6?Fut8siRNA載體；S3、Fut8基因沉默細(xì)胞模型的建立，包括如下分步：S31、用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pSINsi?hU6?Fut8siRNA，pE?ampho載體，pGP載體共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝攜帶有pSINsi?hU6?Fut8siRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒；S32、將3?5×104靶細(xì)胞進(jìn)行9?12h培養(yǎng)，利用7?10ug/mL?polybrane孵育后，通過病毒感染方式將Fut8siRNA轉(zhuǎn)染至靶細(xì)胞內(nèi)；S33、用400?1000ug/ml?G418進(jìn)行篩選，并挑取單個細(xì)胞，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定的Fut8基因沉默細(xì)胞模型。...
【技術(shù)特征摘要】
1.一種核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因沉默細(xì)胞模型的建立方法，其特征在于，包括如下步驟 51、根據(jù)Fut8基因序列，設(shè)計I條21個核苷酸雙鏈Fut8siRNA序列CUGAUCACU CCAGCAGAGA (759-778)； 并設(shè)計Fut8siRNA雙鏈短發(fā)夾結(jié)構(gòu) siRNA-sense:5' -GATCCACTGATCACTCCAGCAGAGATTCAAGAGATCTCTGCTGGAGTGATCAGTTTTTTAT-3';siRNA-antisense:5' -CGATAAAAAAACTGATCACTCCAGCAGAGATCTCTTGAACTCTGCTGGAGTGATCAGTG-3' 52、將該條Fut8siRNA片段重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pSINsi_hU6中，構(gòu)建pSINs1-hU6-Fut8siRNA 載體； 53、Fut8基因沉默細(xì)胞模型的建立，包括如下分步 531、用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將PSINs1-hU6-Fut8siRNA，pE-ampho載體，pGP載體共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝攜帶有PSINs1-hU6-Fut8siRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒； 532、將3-5X IO4靶細(xì)胞進(jìn)行9-12h培養(yǎng)，利用7-...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李文哲，金錦花，
申請(專利權(quán))人：大連大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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