本發明專利技術公開了一個塊根特異啟動子SpoA-p，其具有SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序列。此啟動子克服了組成型啟動子啟動外源基因在受體植物中非特異性持續、高效表達所造成浪費的特點,從而避免了在需要該基因大量表達的特定組織部位則因表達量過低又達不到預期效果。紅薯是屬于塊根作物，此特異啟動子能使根部外源基因得到表達，用于紅薯高淀粉等性狀的定向育種。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及基因工程技術，尤其涉及的是一個塊根特異啟動子SpoA-p，此類啟動子克服了組成型啟動子啟動外源基因在受體植物中非特異性持續、高效表達所造成浪費的特點，從而避免了在需要該基因大量表達的特定組織部位則因表達量過低又達不到預期效果。紅薯是屬于塊根作物，此特異啟動子能使根部外源基因得到表達，用于紅薯高淀粉等性狀的定向育種。
技術介紹
啟動子是指RNA聚合酶及一些反式作用因子識別并與之結合從而正確有效地起始轉錄的一段特異性的DNA序列。不同的啟動子使基因具有不同的表達特性。能夠使基因在大多數的細胞類型中表達的啟動子稱為組成型啟動子，使基因表達能夠對特異條件產生響應的啟動子為特異性啟動子。植物基因工程技術在解決人類所面臨的糧食、能源和環境危機等方面發揮了很大的作用并顯示了良好的前景，在植物育種上，他能導入新的基因引入新的性狀，彌補傳統育種的缺陷。轉基因植物中使用較多的是組成型表達啟動子，它們是植物基因工程中應用最早、最廣泛的一類啟動子。具有持續性，表達量基本恒定。然而，在其發展過程中也不可避免地遇到一些問題，例如外源基因在受體植物內往往會出現表達效率低、表達產物不穩定甚至基因失活或沉默等現象，導致轉基因植物無法投入投入實際應用。也正由于這種特點使得外源基因產物可能對植物的生長發育產生不利影響，甚至導致死亡。此外，重復使用同一種啟動子驅動兩個或兩個以上的外源基因可能引起基因沉默或共抑制現象。而使用組織特異啟動子可以解決這些缺點。甘薯儲藏蛋白(Sporamin)是一類塊根特殊蛋白質，于1985年由Maeshima發現，存在于甘薯塊根中而其他器官中則無(Maeshima et al.，1985),占塊根可溶性蛋白的60%-80%，在植物塊根中以單體的形式出現，與馬鈴薯中的Patatin蛋白以及薯蕷中的Discorin蛋白同屬變態根莖器官中的特異忙藏蛋白。儲藏蛋白分為A、B兩個亞族Sporamin A和 Sporamin B (Hattori et al. , 1989; Murakami et al.，1986),每個亞基因家族都包含6個以上的成員(ffettstein and Chua, 1987)。Sporamin的表達具有塊根特異性，與塊根形態器官的發生有著密切的關系(Hattori and Nakamura, 1988;Hattori et al. , 1991;Ohto et al. , 1992;Takeda etal.，1995)，同時受到植株發育階段和光合產物的調控。Sporamin是甘薯塊根特異貯藏蛋白，其啟動子也應具有塊根特異性，克隆到該啟動子，就可以構建外源基因在甘薯塊根中表達的載體，從而實現甘薯塊根特異表達 外源基因的目的。為此，本研究根據已知Sporamin A基因序列設計引物，通過PCR擴增獲得了啟動子片段，用克隆的啟動子表達GUS基因并分析了該啟動子在煙草和甘薯植株的表達特異性。Sporamin的表達具有塊根特異性，與塊根形態器官的發生有著密切的關系(Hattori and Nakamura, 1988;Hattori et al. ,1991;Ohto et al. , 1992;Takeda etal.，1995)，同時受到植株發育階段和光合產物的調控。Sporamin是甘薯塊根特異貯藏蛋白，其啟動子也應具有塊根特異性，克隆到該啟動子，就可以構建外源基因在甘薯塊根中表達的載體，從而實現甘薯塊根特異表達外源基因的目的。
技術實現思路
本專利技術提供了一個塊根特異啟動子SpoA-p，此啟動子克服了組成型啟動子啟動外源基因在受體植物中非特異性持續、高效表達所造成浪費的特點，從而避免了在需要該基因大量表達的特定組織部位則因表達量過低又達不到預期效果。紅薯是屬于塊根作物，此特異啟動子能使根部外源基因得到表達，用于紅薯高淀粉等性狀的定向育種。。本專利技術的技術方案如下塊根特異啟動子SpoA-p，其具有SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列。組織特異啟動子能使基因定時定位的表達，減少過量表達產物的堆積，SpoAp是一個可誘導性的塊根特異啟動子，該啟動子可以為植物塊根特異表達系統研究提供幫助。有研究表明sporamin含量與甘薯塊根中淀粉含量呈正相關，通過此啟動子的研究能使淀粉合成相關基因在塊根中得到特異表達，提高淀粉含量，探索塊根淀粉、儲藏蛋白的合成機理中的相互關系，為選育獲得聞淀粉新品種奠定基礎。附圖說明圖1 為 SpoA-p 的克隆；M:marker V ; 1-4 IIOObp 的 SpoA-p ；圖2 為雙酶切鑒定 pBI121-SpoA-p:gus ；圖3為轉基因煙草的獲得；其中左圖為葉片侵染后共培養；中間圖為篩選培養上生成愈傷后出苗；右圖為完整煙草再生植株；圖4為轉基因甘薯的陽性植株，其中左圖為莖段在篩選培養基上長成愈傷；中間圖為葉片在篩選培養上生成愈傷；右圖為甘薯完整再生植株；圖5為再生植株PCR鑒定；左圖煙草；M:500bp marker ； 1-7, 8-10:陽性植株；7、11 :陰性植株；12 :陰性對照；13:陽性對照；右圖甘薯;M:marker V ；1 :陰性對照；2 :陽性對照；3_10 :陽性植株；11 :陰性植株；圖6為煙草轉基因植株的⑶S染色；煙草根部⑶S染色成藍色；圖7為煙草對照與轉基因植株蔗糖誘導前后GUS染色情況；A:煙草對照(左)；陽性再生植株(中)；5%蔗糖誘導抗性再生植株(右)；B:b脫去背景色；C:c脫去背景色；D、E、F:分別為C圖中的染色根、葉、莖；G、H:顯微鏡下觀察抗性再生植株根染色；圖8為甘薯轉基因誘導前后⑶S染色，A :轉基因植株⑶S染色；B，C:5%蔗糖誘導后GUS染色；具體實施例方式以下結合具體實施例，對本專利技術進行詳細說明。實施例1、啟動子克隆與 分析川薯34為實驗材料提取總DNA，經電泳檢測及紫外分光光度計分析。設計引物SpoA-p FAAGCTTTGCCAAACAGAGCCTAAATCCATC,SpoA-p R GGATCCTCATGGTGG CAGATGAGATGACAA,下劃線的序列分別為引入的限制性內切酶Hind II1、BamH I的識別位點。PCR擴增片段，擴增條件為94°C 5min，94°C lmin, 56°C lmin20s,72°C lmin，30 個循環。電泳檢測PCR產物，回收片段與克隆載體PMD19-T連接，亞克隆測序，得到了 1144bp的SpoA-p片段(如圖1)。PLACE數據庫(A database of plant cis-acting regulatory DNA elements)在線分析表明此啟動子具有核心啟動子元件CAATB0X1，豌豆豆球蛋白基因中此共有序列能控制組織特異性啟動子的活性；元件SREATMSD跟蔗糖表達相關；959 (-) CANBNNAPA含序列CNAACAC，是油菜儲藏蛋白啟動子核心組件，胚及胚乳中napin蛋白轉錄必須的調控因子，具有特異性；300(_)ELEMENT在大麥醇溶蛋白及小麥麥谷蛋白基因啟動子的上游元件中也存在；959(-)2SSEEDPR 0TBANAPA在很多儲藏蛋白啟動子中存在，與儲藏蛋白基因Nap4啟動子的高活性有重要的關聯；AC本文檔來自技高網...
【技術保護點】
塊根特異啟動子SpoA?p，其具有SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序列。
【技術特征摘要】
1.塊根特異啟動子Sp0A-p，其具有S...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張聰，鄭雪蓮，蒲志剛，張婷，屈會娟，李明，吳潔，譚文芳，楊松濤，王大一，閻文昭，
申請(專利權)人：四川省農業科學院生物技術核技術研究所，
類型：發明
國別省市：
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