本發明專利技術公開了一種生產豬microRNA-378的方法及其專用DNA片段。該DNA片段如SEQIDNO.1所示。含有上述DNA片段的重組載體pSingle-tTS-microRNA-378也屬于本發明專利技術的保護范圍之內。具體地，上述重組載體是將pSingle-tTS載體的多克隆位點插入有SEQ?ID?NO.1所示片段上述的豬microRNA-378前體DNA片段插入pSingle-tTS的XhoΙ位點構成的重組表達載體。將重組載體轉化到細胞系中，用強力霉素誘導表達生產豬microRNA-378；和正常組細胞內microRNA-378表達相比，經誘導底物誘導后microRNA-378表達效率顯著提高，各組間相差極顯著（p＜0.01）。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物
,特別涉及一種控制表達豬microRNA-378表達的方法及專用DNA片段。
技術介紹
microRNA (miRNA)是一種短的、含有22個核苷酸的非編碼RNA，他們可以通過與靶基因的序列完全或不完全的配對來調控基因的表達，動物成熟的miRNA來源于長為80個核苷酸、具有莖環結構RNA的一個臂上。miRNA可以調控細胞的增殖、凋亡、脂肪的代謝、神經類型、造血細胞的分化以及植物葉與花地發育。miRNA可能與增生類的疾病密切相關，事實上在人類基因組中有很多的miRNA都與常見的腫瘤及癌癥有關。大量研究表明，miRNA影響分化及細胞周期，同時影響肌肉的發育。microRNA-378是近年來發現的一個可增加細胞的活力，促進腫瘤的生成過表達可以促進成骨細胞的分化及骨節的形成，對于細胞的增殖與分化有著重要的調節作用的hicioRNA。其對動物機體的影響還有待于進一步的研究。人們在深入了解生物基因調控機制的基礎上，構建出一系列可調控轉基因表達的系統，使所轉基因可按研究者的意愿以時空特異的方式進行表達。目前存在的調控系統很多，其中研究較多、應用最為廣泛的是四環素調控系統(簡稱tet調控系統)；用tet調控系統表達基因是近年來常規調控手段，但該系統能否調控microRNA表達不能預測,特別是對具體的microRNA-378表達能否進行有效調控更是有待研究。將該系統通過添加誘導底物實現外源基因的可控表達。
技術實現思路
為了解決microRNA-378的表達問題，本專利技術提供用于表達microRNA-378的前體片段、表達載體，及表達豬microRNA-378的方法。一種用于表達microRNA-378的前體片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。一種控制表達豬microRNA-378在豬胎兒成纖維細胞中表達的方法。本專利技術提供的增強豬microRNA-378表達量的方法，是將含有上述microRNA-378的前體片段的重組載體導入宿主細胞中，富集具有誘導表達活性的細胞集落群，經誘導底物誘導，目的基因的表達量顯著高于誘導前。具體步驟是(I)將SEQ ID NO.1所示片段插入pSingle-tTS載體的XhoI位點得到重組載體pSingle-tTS-microRNA-378 ； (2)將重組載體口3;[1^16-1:13-111；[。1'01 熟-378 轉化到宿主細胞中，用強力霉素(deoxycycline, D0X)誘導表達。上述microRNA-378的前體片段中含有microRNA-378前體基因。含有上述microRNA-378的前體片段的重組載體也屬于本專利技術的保護范圍之內。具體地，所述重組載體是將上述的microRNA-378前體DNA片段插入pSingle_tTS載體的XhoI位點成的重組表達載體pSingle-tTS-microRNA-378。含有上述miciORNA-378的前體片段轉基因細胞系也屬于本專利技術的保護范圍之內。上述轉基因細胞是將上述SEQ ID NO.1片段導入真核細胞中構成的轉基因細胞。進一步，SEQ ID NO.1的DNA片段是通過上述的重組載體導入所述真核細胞中的。上述真核細胞可以是豬胎兒成纖維細胞。含有上述SEQ ID NO.1所示DNA片段的表達盒或重組菌也屬于本專利技術的保護范圍之內。實驗證明和正常組細胞內microRNA-378表達相比，pSingle-tTS-microRNA-378細胞組誘導前、后表達效率分別是正常細胞組的7. 132倍及318. 653倍；而對照組轉pSingle-tTS誘導前、后表達效率分別是正常細胞組的3. 473及2. 210倍，pSingle-tTS-microRNA-378細胞組經誘導底物誘導后microRNA-378表達效率顯著提高。說明構建的可控表達microRNA-378載體在豬PEF細胞中具有很高的表達效率及誘導表達活性。附圖說明圖1 :PCR擴增豬microRNA-378前體DNA產物電泳圖，M是marker，I是豬microRNA-378 前體 DNA。圖2 :含有microRNA-378前體DNA的真核可控表達載體示意圖 圖3 :實時熒光定量PCR測定各組PEF細胞中microRNA-378的表達水平。1:正常組細胞組；2 pSingle-tTS細胞組，未添加DOX誘導物；3 :pSingle_tTS細胞組,添加DOX誘導物；4 pSingle-tTS-microRNA-378 細胞組，未添加 DOX 誘導物；5 pSingle-tTS-microRNA-378 細胞組，添加 DOX 誘導物。具體實施例方式下面結合具體實施例對本專利技術作進一步說明，但本專利技術并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中，所述百分含量如無特殊說明，均為質量百分含量。本專利技術依賴的遺傳資源是豬(Sus scrofa)(大白豬品系，購自唐山市新基源種豬有限公司)。實施例1真核表達載體pSingle-Tts-microRNA-378的構建以豬(Sus scrofa)(大白豬品系,購自唐山市新基源種豬有限公司)基因組DNA(從豬血液提取而來)為模板，設計并合成I對引物Pl及P2，以豬基因組DNA為模板，高保真酶擴增包含microRNA-378前體片段，引物序列上游引物Pl taCTCGAGATCGCGGGCCTGCTCATTT (下劃線標注為 Xho I 位點)(SEQID NO. 3)下游引物P2 ataCTCGAGGGGAGAGTCCAAAGGGCTG (下劃線標注為 Xho I 位點)(SEQID NO. 4)PCR 擴增反應體系(10μ L) :ddH206. 8μ L ;10XPCR Buffer (Mg2+free) I μ L ;大白豬基因組 DNA 模板 IyL ;Mg2+ (2. 5mM) O. 3 μ L ;引物(10 μ Μ)各 O. 3 μ L ;dNTP (2. 5mM)0. 15 4 1^;0嫩聚合酶0. 15yL ;(高保真酶購自大連寶生物，貨號DR010A)。PCR擴增反應程序94°C變性5min，然后開始PCR反應，共33個循環，94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸40s, 33個循環后于72°C延伸IOmin0PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行擴增產物特異性檢驗(圖1)，可見擴增產物在20(T300bp處有一特異性產物，用QIAGEN瓊脂糖凝膠試劑盒回收純化(操作步驟見公司試劑盒)，用Xho I酶切純化產物；同時用Xho I酶切pSingle-Tts載體(購自clontech公司(貨號PT3923-5 ));將PCR擴增產物和酶切后的載體連接(連接酶購自promega公司，貨號M1804);按公司要求操作步驟轉化DH5ci (購自北京全式金公司，貨號⑶201)感受態大腸桿菌；菌液涂瓊脂糖凝膠板，于37°C培養箱中培養過夜；挑單菌落接種于液體LB培養基中培養，部分菌液送公司測序(invitiOgen北京公司)；選取測序結果表明含有microRNA-378前體DNA的載體，提取質粒備用，將該測序表明正確的質粒命名為pSingle-Tts-microRN本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種用于表達microRNA?378的前體片段，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
【技術特征摘要】
1.一種用于表達microRNA-378的前體片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一種含有權利要求1所述microRNA-378的前體片段的重組載體 pSingle-tTS-microRNA-378，其特征在于，是在pSingle_tTS載體的多克隆位點插入有SEQ ID NO.1所示片段。...
【專利技術屬性】
技術研發人員：鞠輝明，楊躍飛，白立景，姜星，
申請(專利權)人：揚州大學，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。