本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種桑黃菌（火木層孔菌Phellinusigniarius(LexFr)Quel、裂蹄木層孔菌phellinuslinteus(BerketCurt)Teng、鮑氏層孔菌、哈蒂針層孔菌Phellinushartigii(AlleschetSchnabl)Imaz）中尿嘧啶的分離方法。首先制備桑黃菌粗提物，然后進(jìn)行正相硅膠層析，采用石油醚與丙酮梯度洗脫，進(jìn)行TLC檢測(cè)，再次使用正相硅膠層析，然后是甲醇凝膠層析，經(jīng)PLC檢測(cè)后適當(dāng)合并洗脫液，減壓干燥，既得尿嘧啶。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物工程制藥領(lǐng)域。
技術(shù)介紹
桑黃(Phellinus)，子實(shí)體無柄，菌蓋扁半球形或馬蹄形，2_12*3_21厘米，厚1.5-10厘米，木質(zhì)，淺肝褐色至暗灰色或黑色，老時(shí)常龜裂，無皮殼，初期有細(xì)微絨毛，后變無毛，有同心環(huán)棱.邊緣鈍，深肉桂色至淺咖啡色，下側(cè)無子實(shí)層.菌肉深咖啡色，硬，木質(zhì).菌管與菌肉近同色，多層，但層次不明顯，年老的菌管層充滿白色菌絲.管口銹褐色至醬色，圓形，每毫米4-5個(gè).孢子近球形，光滑，無色，5-6*3-4微米.剛毛頂端尖銳，基部膨大，10-25*5-7微米.菌絲不分枝，無橫隔，直徑3-5微米。目前，真菌產(chǎn)物的純化方法較多，主要有分級(jí)沉淀法、制備性高效液相層析、柱層析法、超濾法、離心沉淀色譜法、等幾種方法。而其中應(yīng)用最多的當(dāng)屬柱層析法，分為兩類一是只有分子篩作用的凝膠柱層析，常用的凝膠有葡聚糖凝膠及瓊脂糖凝膠。二是離子交換層析。但，主要用于分離多糖，透明質(zhì)酸等，多數(shù)分離后得到的產(chǎn)物為混合物。本專利技術(shù)使用多種層析技術(shù)相結(jié)合，分離度高，應(yīng)用此專利技術(shù)可以精致到純品。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)公開了一種桑黃菌中尿嘧啶的分離方法。首先制備桑黃粗提物，然后進(jìn)行正相硅膠層析，采用石油醚與丙酮梯度洗脫，進(jìn)行TLC檢測(cè)，再次使用正相硅膠層析，然后是甲醇凝膠層析，經(jīng)PLC檢測(cè)后適當(dāng)合并洗脫液，減壓干燥，既得尿嘧啶。本專利技術(shù)的技術(shù)方案如下 桑黃粗提物，由下述方法制得 (1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計(jì)是 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5% 硫酸鎂 O. 1-0. 5%磷酸二氫鉀O. 01-0. 05% (2)將桑黃菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶?jī)?nèi)，以20 35°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為80 280r/min，pH 3 8條件下，震動(dòng)培養(yǎng)7 15天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到2.5 4時(shí)，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度20 35°C，發(fā)酵罐壓力O.1 O. 2公斤/平方厘米，pH 3 8，通氣量O. 5 1.1vvm,攪拌速度100 280轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7 15天，即可利用桑黃菌絲體發(fā)酵全液制備桑黃粗提物； (3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2 1/5 ； (4)用體積百分比為60 95%的乙醇對(duì) 上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2 5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達(dá)到60 90% ； (5)對(duì)步驟(4)所得提取液在50 70°C條件下，加熱I 2小時(shí)；以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過二級(jí)過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 1/10 ； (6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進(jìn)行干燥，得桑黃粗提物。分離尿嘧啶的方法 桑黃菌粗提物一正相硅膠層析一氯仿與甲醇梯度洗脫一TLC檢測(cè)一正相硅膠層析一甲醇凝膠層析一TLC檢測(cè)一TLC檢測(cè)一減壓蒸干一白色粉末(尿嘧啶)。具體方法為 (1)制備桑黃菌粗提物； (2)將上述步驟(I)所得的粗提物與正相硅膠混勻攪拌，并干燥，進(jìn)行硅膠正相柱層析，用洗脫劑洗脫2-7次； (3)收集步驟(2)中最后一次洗脫液，減壓干燥，與等體積硅膠拌樣，再次進(jìn)行正相硅膠層析，用洗脫劑洗脫； (4)收集上述步驟(3)中的洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，甲醇凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫； (5)TLC檢測(cè) 步驟(4)的洗脫液，適度合并洗脫液，加壓干燥，即為尿嘧啶。本專利技術(shù)由桑黃菌中尿嘧啶的分離技術(shù)的顯著優(yōu)勢(shì)本方法采用多種層析技術(shù)相結(jié)合，可以精致到結(jié)構(gòu)明確，純度大于95%的尿嘧啶。技術(shù)路線成熟明確，高效精確。附圖說明 圖1為本專利技術(shù)尿嘧啶的結(jié)構(gòu)式； 圖2為尿嘧啶的一維核磁共振H譜 具體實(shí)施方式 實(shí)例1: 桑黃粗提物，由下述方法制得 (1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計(jì)是 玉米淀粉 1%葡萄糖 1% 蛋白胨 O. 1%酵母膏 O. 1% 硫酸鎂 O. 1%磷酸二氫鉀0.01% (2)將桑黃菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶?jī)?nèi)，以25°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為110r/min，pH 7條件下，震動(dòng)培養(yǎng)7天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到3時(shí)，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度25°C，發(fā)酵罐壓力O.1公斤/平方厘米，pH 3，通氣量O. 5-1. lvvm，攪拌速度100轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7天，即可利用桑黃菌絲體發(fā)酵全液制備桑黃粗提物； (3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/3 ； (4)用體積百分比為70%的乙醇對(duì)上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達(dá)到55% ； (5)對(duì)步驟(4)所得提取液在70°C條件下，加熱I小時(shí)；以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過二級(jí)過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 ；(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進(jìn)行干燥，得桑黃粗提物。將上述粗提物稱取200g與等體積100目正相硅膠混勻攪拌，進(jìn)行硅膠正相柱層析。層析固定相為200-300目正相硅膠，柱高lm，直徑20cm，洗脫劑為分別為氯仿，氯仿甲醇=100:1,氯仿甲醇=50:1,氯仿甲醇=10:1,氯仿甲醇=5:1,分別洗脫3,4,4,4，4個(gè)柱體積。并將所得洗脫液分別命名為Fr-l，F(xiàn)r-2，F(xiàn)r_3，F(xiàn)r_4，F(xiàn)r_5。將Fr_5等體積硅膠拌樣，使用娃膠為100目正相娃膠,五倍體積娃膠層析,使用的娃膠為200—300目正相娃膠。洗脫劑為氯仿與甲醇。減壓濃縮洗脫液，使用甲醇溶解，甲醇凝膠柱層析，用甲醇洗脫。使用TLC檢測(cè)收集的洗脫液適當(dāng)合并，得到白色粉末，進(jìn)行ID-HNMR核磁共振分析，頻率為400MHZ，分析結(jié)果為δ 7.41，7.39，5.62，5.61.證明其為尿嘧啶。實(shí)例2: 桑黃粗提物，由下述方法制得 (1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計(jì)是 玉米淀粉 3%葡萄糖 2% 蛋白胨 0.5%酵母膏 0.5% 硫酸鎂 0.5%磷酸二氫鉀0.05% (2)將桑黃菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶?jī)?nèi)，以30°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為180r/min，pH6條件下，震動(dòng)培養(yǎng)15天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到2. 5時(shí)，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度30°C，發(fā)酵罐壓力0.2公斤/平方厘米，pH 3，通氣量O. 5-1.1vvm,攪拌速度180轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)15天，即可利用桑黃菌絲體發(fā)酵全液制備桑黃粗提物； (3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 ； (4)用體積百分比為90%的乙醇對(duì)上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的4倍，能夠使提取液中乙醇濃度達(dá)到70% ； (5)對(duì)步驟(4)所得提取液在55°C條件下，加熱2.5小時(shí)；以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過二級(jí)過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
桑黃菌中尿嘧啶的分離方法，其步驟順序如下：(1)?制備桑黃粗提物；(2)將上述步驟（1）所得的乙醇沉淀物與正相硅膠混勻攪拌，并干燥，進(jìn)行硅膠正相柱層析，用洗脫劑洗脫2?7次；(3)收集步驟（2）中最后一次洗脫液，減壓干燥，與等體積硅膠拌樣，再次進(jìn)行正相硅膠層析，用洗脫劑洗脫；(4)收集上述步驟（3）中的洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，甲醇凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫；(5)TLC檢測(cè)步驟（4）的洗脫液，適度合并洗脫液，加壓干燥，即為尿嘧啶。
【技術(shù)特征摘要】
1.桑黃菌中尿嘧啶的分離方法，其步驟順序如下 (1)制備桑黃粗提物； (2)將上述步驟(I)所得的こ醇沉淀物與正相硅膠混勻攪拌，并干燥，進(jìn)行硅膠正相柱層析，用洗脫劑洗脫2-7次； (3)收集步驟(2)中最后一次洗脫液，減壓干燥，與等體積硅膠拌樣，再次進(jìn)行正相硅膠層析，用洗脫劑洗脫； (4)收集上述步驟(3)中的洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，甲醇凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫； (5)TLC檢測(cè)步驟(4)的洗脫液，適度合并洗脫液，加壓干燥，即為尿嘧啶。2.如權(quán)利要求1所述的ー種從桑黃菌中分離苯こ醇的方法，其特征在于所述桑黃粗提物，由下述方法制得 (1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計(jì)是 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5% 硫酸鎂 0. 1-0. 5%磷酸ニ氫鉀0. 01-0. 05% (2)如權(quán)利要求1所述桑黃粗提物的發(fā)酵培養(yǎng)方法是，將桑黃菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶?jī)?nèi)，以20 35°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為80 280r/min，pH 3 8條件下，震動(dòng)培養(yǎng)7 15天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到2. 5 4時(shí)，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度20 35°C，發(fā)酵罐壓カ0.1 0. 2公斤/平方厘米，pH 3 8，通氣量0. 5 1.1vvm,攪拌速度100 280轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7 15天，即可利用桑黃菌絲體發(fā)酵全液制備桑黃粗提物； (3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：趙晨，宋愛榮，孫效樂，王進(jìn)平，秦丹，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
還沒有人留言評(píng)論。發(fā)表了對(duì)其他瀏覽者有用的留言會(huì)獲得科技券。