本發明專利技術公開了一種桑黃菌（火木層孔菌Phellinusigniarius(LexFr)Quel、裂蹄木層孔菌phellinuslinteus(BerketCurt)Teng、鮑氏層孔菌、哈蒂針層孔菌Phellinushartigii(AlleschetSchnabl)Imaz）中環二肽C4的分離方法。首先制備桑黃菌粗提物，然后進行正相硅膠層析，然后是甲醇氯仿梯度洗脫，然后進行氯甲凝膠層析，再次進行正相硅膠層析，再次甲醇凝膠層析，最后是常壓反相制備，經HPLC檢測，1D-HNMR檢測后，最終得到環二肽C4。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物工程制藥領域。
技術介紹
桑黃(Phellinus)，子實體無柄，菌蓋扁半球形或馬蹄形，2_12*3_21厘米，厚1.5-10厘米，木質，淺肝褐色至暗灰色或黑色，老時常龜裂，無皮殼，初期有細微絨毛，后變無毛，有同心環棱.邊緣鈍，深肉桂色至淺咖啡色，下側無子實層.菌肉深咖啡色，硬，木質.菌管與菌肉近同色，多層，但層次不明顯，年老的菌管層充滿白色菌絲.管口銹褐色至醬色，圓形，每毫米4-5個.孢子近球形，光滑，無色，5-6*3-4微米.剛毛頂端尖銳，基部膨大，10-25*5-7微米.菌絲不分枝，無橫隔，直徑3-5微米。目前，真菌產物的純化方法較多，主要有分級沉淀法、制備性高效液相層析、柱層析法、超濾法、離心沉淀色譜法、等幾種方法。而其中應用最多的當屬柱層析法，分為兩類:一是只有分子篩作用的凝膠柱層析，常用的凝膠有葡聚糖凝膠及瓊脂糖凝膠。二是離子交換層析。但，主要用于分離多糖，透明質酸等，多數分離后得到的產物為混合物。本專利技術使用多種層析技術相結合，分離度高，應用此專利技術可以精致到純品。
技術實現思路
本專利技術公開了一種桑黃菌(火木層孔菌igniarius (L ex Fr) Quel、裂蹄木層孔菌phellinus linteus (Berk et Curt) Teng、鮑氏層孔菌、哈蒂針層孔菌Phellinus hartigii (Allesch et Schnabl) Imaz)中環二妝 C4 的分離方法。首先制備桑黃菌粗提物，然后進行正相硅膠層析，然后是甲醇氯仿梯度洗脫，然后進行氯甲凝膠層析，再次進行正相硅膠層析，再次甲醇凝膠層析，最后是常壓反相制備，經HPLC檢測，ID-HNMR檢測后，最終得到環二肽C4。此化合物目前已報道具有抑制鰻弧菌繁殖的作用。本專利技術的技術方案如下: 桑黃粗提物，由下述方法制得: (1)發酵培養基配方以克/100毫升計是: 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5% 硫酸鎂 0.1-0.5%磷酸二氫鉀0.01-0.05% (2)將桑黃菌種以常規方法接種到裝有液體培養基的三角燒瓶內，以20 35°C溫度，搖瓶轉速為80 280r/min，pH 3 8條件下，震動培養7 15天；培養中當pH值降到2.5 4時，將搖瓶中的種子接種到50L發酵罐的培養液中，以溫度20 35°C，發酵罐壓力0.1 0.2公斤/平方厘米，pH 3 8，通氣量0.5 1.1vvm,攪拌速度100 280轉/分的條件，培養7 15天，即可利用桑黃菌絲體發酵全液制備桑黃粗提物； (3)取步驟(2)中所得桑 黃菌絲體發酵全液，將其以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2 1/5 ；(4)用體積百分比為60 95%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2 5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到60 90% ； (5)對步驟(4)所得提取液在50 70°C條件下，加熱I 2小時；以常規方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 1/10 ； (6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得桑黃粗提物。桑黃菌粗提物一正相硅膠層析一氯仿與甲醇凝膠層析一TLC檢測一正相硅膠層析一甲醇凝膠層析一TLC檢測一反相硅膠層析一HPLC檢測一減壓蒸干一環二肽C4。具體方法為: (1)制備桑黃菌粗提物； (2)將上述步驟(I)所得的粗提物與正相硅膠混勻攪拌，并干燥，進行硅膠正相柱層析，用洗脫劑洗脫2-5次； (3)收集上述步驟(2)中最后一次洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇與氯仿溶解，氯甲凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測收集的洗脫液，適當合并洗脫液，減壓干燥； (4)將步驟(3)中的產物再次進行一次正相硅膠層析，然后進行甲醇凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫； (5)將步驟(4)中的產物進行反相硅膠層析，洗脫劑為甲醇和水； (6)收集洗脫液，HPLC檢測，減壓干燥，即為環二肽C4。 本專利技術由桑黃菌中環二肽C4的分離技術的顯著優勢:本方法采用多種層析技術相結合，可以精致到結構明確，純度大于95%的環二肽C4。技術路線成熟明確，高效精確。附圖說明圖1為環二肽C4的結構式； 圖2為環二肽C4的一維核磁共振H譜。具體實施例方式實例1: 桑黃粗提物，由下述方法制得: (1)發酵培養基配方以克/100毫升計是: 玉米淀粉 1%葡萄糖 1% 蛋白胨 0.1%酵母膏 0.1% 硫酸鎂 0.1%磷酸二氫鉀0.01% (2)將桑黃菌種以常規方法接種到裝有液體培養基的三角燒瓶內，以25°C溫度，搖瓶轉速為110r/min，pH 7條件下，震動培養7天；培養中當pH值降到3時，將搖瓶中的種子接種到50L發酵罐的培養液中，以溫度25°C，發酵罐壓力0.1公斤/平方厘米，pH 3，通氣量0.5-1.lvvm，攪拌速度100轉/分的條件，培養7天，即可利用桑黃菌絲體發酵全液制備桑黃粗提物； (3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發酵全液，將其以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/3 ；(4)用體積百分比為70%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到55% ； (5)對步驟(4)所得提取液在70°C條件下，加熱I小時；以常規方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 ； (6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得桑黃粗提物。將上述所得粗提物稱取50g與等體積100目正相硅膠混勻攪拌，進行硅膠正相柱層析。層析固定相為200目正相硅膠，柱高0.5m，直徑10cm，分別洗脫3個柱體積。并將所得洗脫液分別命名為Fr-l，Fr-2。將Fr_2用氯仿:甲醇=1: 1，溶解，進行，氯甲凝膠層析，收集洗脫液，TLC檢測，適當合并，然后與等體積100目正相硅膠混合，五倍體積硅膠層析，使用的硅膠為200目正相硅膠。洗脫劑為氯仿與甲醇。減壓濃縮洗脫液，使用甲醇溶解，甲醇凝膠柱層析。使用TLC檢測收集的洗脫液適當合并，減壓蒸干，10%甲醇溶解，進行反相硅膠層析，洗脫劑為甲·醇與水，HPLC檢測，條件為Omin:0%甲醇，IOmin:100%甲醇，出峰時間為4.82min。適當合并，減壓干燥，進行ID-HNMR核磁共振分析，頻率為400MHZ，分析結果為 δ 6.64 (s, 1Η), 4.09 (dd, J = 10.2, 6.4 Hz, 1H), 3.77 - 3.71 (m, 1H)，3.71-3.65 (m, 1H), 3.52 (ddd, J = 11.7, 8.8，2.6 Hz, 1H)，2.45 - 2.36 (m, 1H)，2.28 - 2.17 (m, 1H)，2.07 - 1.98 (m, 1H)，1.97 -1.75 (m, 3H)，1.04 (d, J =6.9Hz, 3H), 0.98 (d, J = 6.8 Hz, 3H).證明是(L-腦氨酸-L-纟顏氨酸)本文檔來自技高網...
【技術保護點】
桑黃菌中環二肽C4的分離方法，其步驟順序如下：(1)制備桑黃菌粗提物；(2)將上述步驟（1）所得的粗提物與正相硅膠混勻攪拌，并干燥，進行硅膠正相柱層析，用洗脫劑洗脫2?5次；?(3)收集上述步驟（2）中最后一次洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇與氯仿溶解，氯甲凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測收集的洗脫液，適當合并洗脫液，減壓干燥；(4)將步驟（3）中的產物再次進行一次正相硅膠層析，然后進行甲醇凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫；(5)將步驟（4）中的產物進行反相硅膠層析，洗脫劑為甲醇和水；(6)收集洗脫液，HPLC檢測，減壓干燥，即為環二肽C4。
【技術特征摘要】
1.桑黃菌中環二肽C4的分離方法，其步驟順序如下: (1)制備桑黃菌粗提物； (2)將上述步驟(I)所得的粗提物與正相硅膠混勻攪拌，并干燥，進行硅膠正相柱層析，用洗脫劑洗脫2-5次； (3)收集上述步驟(2)中最后一次洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇與氯仿溶解，氯甲凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測收集的洗脫液，適當合并洗脫液，減壓干燥； (4)將步驟(3)中的產物再次進行一次正相硅膠層析，然后進行甲醇凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫； (5)將步驟(4)中的產物進行反相硅膠層析，洗脫劑為甲醇和水； (6)收集洗脫液，HPLC檢測，減壓干燥，即為環二肽C4。2.如權利要求1所述的一種從桑黃菌中分離苯乙醇的方法，其特征在于所述桑黃粗提物，由下述方法制得: (1)發酵培養基配方以克/100毫升計是:3.如權利要求1所述的桑黃菌中環二肽C4的分離方法，其特征在于所述的環二肽C4為環(L-脯氨酸-L-纈氨酸)。4.如權利要求1所述的桑黃菌...
【專利技術屬性】
技術研發人員：宋愛榮，趙晨，孫效樂，楊松，秦丹，
申請(專利權)人：青島農業大學，
類型：發明
國別省市：
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