本發明專利技術公開了一種桑黃菌（火木層孔菌Phellinus?igniarius(L?ex?Fr)Quel、裂蹄木層孔菌phellinus?linteus(Berk?et?Curt)Teng、鮑氏層孔菌、哈蒂針層孔菌Phellinus?hartigii(Allesch?et?Schnabl)Imaz）中一種苯乙酮的分離技術。首先制備桑黃菌粗提物，然后進行正相硅膠層析以氯仿與甲醇梯度洗脫，使用TLC檢測檢測洗脫液，然后進行甲醇凝膠層析，再次進行TLC檢測，接著使用反相硅膠層析，經過TLC檢測，將產物減壓蒸干既得無色油狀物為一種苯乙酮。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物工程制藥領域。
技術介紹
桑黃，子實體無柄，菌蓋扁半球形或馬蹄形，2-12*3-21厘米，厚1. 5-10厘米，木質，淺肝褐色至暗灰色或黑色，老時常龜裂，無皮殼，初期有細微絨毛，后變無毛，有同心環棱.邊緣鈍，深肉桂色至淺咖啡色，下側無子實層.菌肉深咖啡色，硬，木質.菌管與菌肉近同色，多層，但層次不明顯，年老的菌管層充滿白色菌絲.管口銹褐色至醬色，圓形，每毫米4-5個.孢子近球形，光滑，無色，5-6*3-4微米.剛毛頂端尖銳，基部膨大，10-25*5-7微米.菌絲不分枝，無橫隔，直徑3-5微米。目前，真菌產物的純化方法較多，主要有分級沉淀法、制備性高效液相層析、柱層析法、超濾法、離心沉淀色譜法、等幾種方法。而其中應用最多的當屬柱層析法，分為兩類一是只有分子篩作用的凝膠柱層析，常用的凝膠有葡聚糖凝膠及瓊脂糖凝膠。二是離子交換層析。但，主要用于分離多糖，透明質酸等，多數分離后得到的產物為混合物。本專利技術使用多種層析技術相結合，分離度高，應用此專利技術可以精致到純品。
技術實現思路
本專利技術公開了一種桑黃菌(火木層孔菌/%<977i/W5· igniarius (L ex Fr) Quel、裂蹄木層孔菌phellinus linteus (Berk et Curt) Teng、鮑氏層孔菌、哈蒂針層孔菌Phellinus hartigii (Allesch et Schnabl) Imaz)中一種苯乙酮的分離技術。首先制備桑黃粗提物，然后進行正相硅膠層析以氯仿與甲醇梯度洗脫，使用TLC檢測檢測洗脫液，然后進行甲醇凝膠層析，再次進行TLC檢測，接著使用反相硅膠層析，經過TLC檢測，將產物減壓蒸干既得無色油狀物為 一種苯乙酮。本專利技術的技術方案如下 桑黃粗提物，由下述方法制得 (1)發酵培養基配方以克/100毫升計是 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 O. 1-0. 5%酵母膏 O. 1-0. 5% 硫酸鎂 O. 1-0. 5%磷酸二氫鉀O. 01-0. 05% (2)將桑黃菌種以常規方法接種到裝有液體培養基的三角燒瓶內，以20 35°C溫度，搖瓶轉速為80 280r/min，pH 3 8條件下，震動培養7 15天；培養中當pH值降到2. 5 4時，將搖瓶中的種子接種到50L發酵罐的培養液中，以溫度20 35°C，發酵罐壓力O.1 O. 2公斤/平方厘米，pH 3 8，通氣量O. 5 1.1vvm,攪拌速度100 280轉/分的條件，培養7 15天，即可利用桑黃菌絲體發酵全液制備桑黃粗提物； (3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發酵全液，將其以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2 1/5 ；(4)用體積百分比為60 95%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2 5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到60 90% ； (5)對步驟(4)所得提取液在50 70°C條件下，加熱I 2小時；以常規方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 1/10 ； (6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得桑黃粗提物。桑黃菌粗提物一乙醇沉淀一正相硅膠層析一氯仿與甲醇梯度洗脫一TLC檢測一甲醇凝膠層析一TLC檢測一反相硅膠層析一TLC檢測一減壓蒸干一無色油狀物(一種苯乙酮)。具體方法為 (1)制備桑黃菌粗提物； (2)將上述步驟(I)所得的粗提物與正相硅膠混勻攪拌，置于通風設備處干燥并攪拌； (3)對上述步驟(2)后制備的 原料進行硅膠正相柱層析，使用洗脫劑洗脫2至5次，得到洗脫液； (4)將步驟(3)中的最后一次洗脫液等體積硅膠拌樣，進行硅膠層析，使用洗脫劑洗脫； (5)收集步驟(4)的洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，進行甲醇凝膠柱層析，使用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測收集的洗脫液，適當合并洗脫液，減壓干燥； (6)對步驟(5)得到的產物進行常壓反相柱層析，使用洗脫劑洗脫； (7)收集步驟(6)得到的洗脫液，使用TLC檢測各洗脫液，適度合并洗脫液，減壓干燥，即為苯乙酮。本專利技術的顯著優勢本方法采用多種層析技術相結合，可以精致到結構明確，純度大于95%的一種苯乙酮。技術路線成熟明確，高效精確。附圖說明 圖1為3’，4’ - 二羥基苯乙酮的結構式； 圖2為3’，4’ - 二羥基苯乙酮的一維核磁共振H譜。具體實施方式 實例1: 桑黃粗提物，由下述方法制得 (1)發酵培養基配方以克/100毫升計是 玉米淀粉 1%葡萄糖 1% 蛋白胨 O. 1%酵母膏 O. 1% 硫酸鎂 O. 1%磷酸二氫鉀0.01% (2)將桑黃菌種以常規方法接種到裝有液體培養基的三角燒瓶內，以25°C溫度，搖瓶轉速為110r/min，pH 7條件下，震動培養7天；培養中當pH值降到3時，將搖瓶中的種子接種到50L發酵罐的培養液中，以溫度25°C，發酵罐壓力O.1公斤/平方厘米，pH 3，通氣量O. 5-1. lvvm，攪拌速度100轉/分的條件，培養7天，即可利用桑黃菌絲體發酵全液制備桑黃粗提物； (3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發酵全液，將其以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/3 ； (4)用體積百分比為70%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到55% ； (5)對步驟(4)所得提取液在70°C條件下，加熱I小時；以常規方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 ； (6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得桑黃粗提物。將上述桑黃粗提物稱取300g與等體積100目正相硅膠混勻攪拌，至于通風設備處干燥并攪拌，然后進行硅膠正相柱層析。層析固定相為200-300目正相硅膠，柱高lm，直徑20cm，洗脫劑為分別為氯仿，氯仿甲醇=100:1，氯仿甲醇=500:1，氯仿甲醇=100:1.每種洗脫劑洗脫體積分別為2，3，3，3個柱體積。并將所得洗脫液分別命名為Fr-l，Fr-2，Fr-3，Fr-4。將Fr_4等體積硅膠拌樣，使用硅膠為100目正相硅膠，五倍體積硅膠層析，使用的硅膠為200目正相硅膠。洗脫劑為氯仿。收集上述洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，甲醇凝膠柱層析。使用TLC檢測收集的洗脫液，合并收集出現紅色斑點的洗脫液，減壓蒸干，使 用20%甲醇溶解上述產物，進行常壓反相柱層析，洗脫劑為20%-100%甲醇。收集洗脫液，使用TLC檢測各洗脫液，合并收集出現紅色斑點的洗脫液。減壓干燥，進行ID-HNMR核磁共振分析，頻率為400MHZ，分析結果為δ 7. 43 (d, J = 8. 6 Hz, 19H),6. 81 (d, J = 7.9 Hz, 10H), 2. 49 (s, 27H)，2. 42 (s, 2H) ·說明其為 3’，4’ - 二羥基苯乙酮。 實例2 桑黃粗提物，由下述方法制得 (1)發酵培養基配方以克/100毫升計是 玉米淀粉 3%葡萄糖 2% 蛋本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種從桑黃菌中分離苯乙酮方法，其步驟順序如下：(1)制備桑黃粗提物；(2)將上述步驟（1）所得的粗提物與正相硅膠混勻攪拌，置于通風設備處干燥并攪拌；(3)對上述步驟（2）后制備的原料進行硅膠正相柱層析，使用洗脫劑洗脫2至5次，得到洗脫液；(4)將步驟（3）中的最后一次洗脫液等體積硅膠拌樣，進行硅膠層析，使用洗脫劑洗脫；(5)收集步驟（4）的洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，進行甲醇凝膠柱層析，使用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測收集的洗脫液，適當合并洗脫液，減壓干燥；(6)對步驟（5）得到的產物進行常壓反相柱層析，使用洗脫劑洗脫；(7)收集步驟（6）得到的洗脫液，使用TLC檢測各洗脫液，適度合并洗脫液，減壓干燥，即為苯乙酮。
【技術特征摘要】
1.一種從桑黃菌中分離苯乙酮方法，其步驟順序如下 (1)制備桑黃粗提物； (2)將上述步驟(I)所得的粗提物與正相硅膠混勻攪拌，置于通風設備處干燥并攪拌； (3)對上述步驟(2)后制備的原料進行硅膠正相柱層析，使用洗脫劑洗脫2至5次，得到洗脫液； (4)將步驟(3)中的最后一次洗脫液等體積硅膠拌樣，進行硅膠層析，使用洗脫劑洗脫； (5)收集步驟(4)的洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，進行甲醇凝膠柱層析，使用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測收集的洗脫液，適當合并洗脫液，減壓干燥； (6)對步驟(5)得到的產物進行常壓反相柱層析，使用洗脫劑洗脫； (7)收集步驟(6)得到的洗脫液，使用TLC檢測各洗脫液，適度合并洗脫液，減壓干燥，即為苯乙酮。2.如權利要求1所述的一種從桑黃菌中分離苯乙醇的方法，其特征在于所述桑黃粗提物，由下述方法制得 (1)發酵培養基配方以克/100毫升計是 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5% 硫酸鎂 O. 1-0. 5%磷酸二氫鉀O. 01-0. 05% (2)如權利要求1所述桑黃粗提物的發酵培養方法是，將桑黃菌種以常規方法接種到裝有液體培養基的三角燒瓶內，以20 35 °C溫度，搖瓶轉速為80 280r/min，pH 3 8條件下，震動培養7 15天；培養中當pH值降到2. 5 4時，將搖瓶中的種子接種到50L發酵罐的培養液中，以溫度20 35°C，發酵罐壓力O.1 O. 2公斤/平方厘米，pH 3 8，通氣量O. 5 1.1vvm,攪拌速度100 280轉/分的條件，培養7 15天，即可利用桑黃菌絲體發酵全液制備桑黃粗提物； (3)取步驟(2)中所得...
【專利技術屬性】
技術研發人員：宋愛榮，趙晨，孫效樂，黃芳，丁偉，
申請(專利權)人：青島農業大學，
類型：發明
國別省市：
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