一種魚類鮮度K值測定樣品前處理方法技術

本發明專利技術公開了一種魚類鮮度K值測定樣品前處理方法，該方法取0.8-1.2g魚肉樣品，放入容器中，添加質量濃度為2.5-10%的高氯酸的水溶液，魚肉樣品與高氯酸的水溶液的質量體積比為0.1，在冰水浴條件下攪拌10-20分鐘；然后往容器中添加濃度為1M的KOH，調節pH值至2-3.5；最后加蒸餾水或去離子水定容至20mL，通過0.45微米的微濾膜過濾除去可能含有的雜質。在濾液中添加0.2-1mL的濃度為0.1M、pH為7.5的磷酸緩沖液，即得到K值分析用的預處理樣品；本發明專利技術的方法簡單易行，省時省力，降低對儀器的依賴，提高了處理效率，確保測定精度。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及分析測試
，尤其涉及一種改進的魚類鮮度K值測定樣品前處理方法。
技術介紹
鮮度是水產品價值的重要衡量指標。K值是表示鮮度的一個指標，自1959年提出這個概念后，測定K值所需的提取ATP關聯化合物的方法卻沒有很大改進。魚死亡早期，其自身的酶活性仍在活動，魚的早期鮮度取決于自身的生物化學反應。將肌苷和次黃嘌嶺之和對ATP各級降鮮產物之和的比值即K值作為評定魚類鮮度的重要化學指標，該法對魚類鮮度進行評定行之有效，目前已為世界各國采用。測定的關鍵在于對魚肉樣品中所含核苷酸不同階段的分解物進行定量。而核苷酸及其分解產物的提取是否充分，提取過程是否迅速高效，對K值的測定精度具有極大的影響。傳統的樣品處理方法是將魚肉在高氯酸中勻漿，使得與ATP及其關聯產物分解相關的酶失活，同時抽提出酸可溶性核苷酸分解產物。離心分離上清液，沉淀多次重復抽提，最后合并上清液。為防止ATP在酸性條件下分解，抽提出的上清液應盡快用KOH中和。另夕卜，采用KOH中和還能除去高氯酸，避免其阻礙ATP關聯產物在后續離子交換樹脂的吸附。以上操作，步驟較多，處理不便，多個步驟必然造成系統誤差，導致測定精度的低下；且處理時間長，有可能導致ATP關聯產物的非生理性分解，導致測定誤差。
技術實現思路
本專利技術的目的在于針對現有技術的不足，提供一種改進的魚類鮮度K值測定樣品前處理方法。本專利技術的目的是通過以下技術方案來實現的一種魚類鮮度K值測定樣品前處理方法，包括以下步驟 (1)取0.8-1. 2g魚肉樣品，放入容器中，添加質量濃度為2. 5-10%的高氯酸的水溶液，魚肉樣品與高氯酸的水溶液的質量體積比為0. l(g/mL)，在冰水浴條件下攪拌10-20分鐘； (2)往容器中添加濃度為IM的K0H，調節pH值至2-3.5 ； (3)加蒸餾水或去離子水定容至20mL，通過0.45微米的微濾膜過濾除去可能含有的雜質。在濾液中添加0. 2-lmL的濃度為0. 1M、pH為7. 5的磷酸緩沖液，即得到K值分析用的預處理樣品。本專利技術的有益效果是，本專利技術的方法簡單易行，省時省力，降低對儀器的依賴，提高了處理效率，確保測定精度。具體實施例方式一種魚類鮮度K值測定樣品前處理方法，包括以下步驟1、取0. 8-1. 2g魚肉樣品，放入容器中，添加質量濃度為2. 5-10%的高氯酸的水溶液，魚肉樣品與高氯酸的水溶液的質量體積比為0.1 (g/mL)，在冰水浴條件下攪拌10-20分鐘。高氯酸可使魚肉中含有的ATP及其關聯產物分解酶類失活，傳統方法為提高ATP及其關聯產物的提取得率，采用勻漿的方法使得魚肉微細化。但是，附聚在勻漿機器件及容器皿上的樣品收集比較困難；樣本較多時，勻漿處理亦耗時耗力。研究發現，若樣品為0. 8-1. 2g,無論是直接在魚肉中添加高氯酸,還是把魚肉樣品切成若干小塊,或者經過細致均勻的剁碎，添加高氯酸水溶液后抽提出的核苷酸關聯物的量測定結果沒有明顯的差異。故本專利技術略去細切、剁碎、勻漿的操作，直接在0. 8-1. 2g魚肉樣品中添加高氯酸，以玻璃棒攪拌，提取10-20分鐘。傳統方法為確保ATP及其關聯產物的提取得率，至少重復抽提2次以上，即通過離心分離，將上清液轉移到其他容器中，所得沉淀繼續添加高氯酸勻漿后再離心，棄去沉淀，合并上清液。研究發現，一次提取所得上清液中ATP及其關聯產物的得率最高，重復抽提液中亦能測定到很低含量的產物。考慮傳統方法中經離心分離操作，這些少量可測定產物很可能是附著在離心管壁上的殘留物。另外，提取時間從5分鐘到30分鐘，所得結果大致相同。本專利技術結合后續步驟，省略多次離心轉移容器的操作，采用I次高氯酸提取10-20分鐘，無需離心，保留沉淀，直接進入后續的中和操作。2、往容器中添加濃度為IM的K0H，調節pH值至2-3. 5。傳統方法在離心上清液中盡快添加KOH進行中和反應，以防止沉淀中的魚肉蛋白質變性，在中和后復溶，影響核苷酸及其關聯產物的測定。但是，因為添加的KOH為強堿，中和終點附近PH變化較快，很難迅速達到中和終點，且pH計或pH試紙必不可少，pH的測定與調節需要耗時耗力。研究發現，調節PH至2-3. 5之間，經高氯酸溶解的核苷酸及其關聯產物在此酸堿度范圍內測定值較穩定，但PH4-6范圍內，測定值不夠穩定，有受變性蛋白影響的可能。故本專利技術用KOH中和不是到中性的pH7.0，而是調整反應體系至pH3.0附近。另外，采用I次性添加高氯酸提取后保留沉淀，不離心處理，直接在提取體系中添加K0H。因為添加的高氯酸量是已知的，可通過酸堿反應方程式計算相應添加的堿量，一次性添加堿液后，迅速達到預期PH值，無需依賴pH儀器或試紙，也省略了測定調節的操作，省時省力，特別有利于戶外采樣。采集樣本較多時，尤其具有優勢。3、加蒸餾水或去離子水定容至20mL，通過0. 45微米的微濾膜過濾除去可能含有的雜質。在濾液中添加0. 2-lmL的濃度為0. 1M、pH為7. 5的磷酸緩沖液，即得到K值分析用的預處理樣品。一般認為ATP在酸性條件下不能長期穩定存在，而高效液相色譜法測定時耗時3-4個小時，樣品較多時預處理樣品需較長時間保存。研究發現，在ATP溶液中添加1-5%的高氯酸，室溫下放置13小時后，5%的高氯酸可使60%的ATP分解；1%的高氯酸可使20%的ATP分解。不同pH范圍，ATP變性程度亦不相同。pHl. 0條件下，室溫放置13小時，15%左右的ATP分解，pH3. 0-pH7. 0范圍內只有不到2%左右的ATP發生分解。通過高效液相色譜進行檢測，發現PH1. 0條件下保藏13小時后，15%的ATP分解成ADP，但未繼續分解成AMP或MP。但是，在pH3. 0和pH7. 0的條件下，同樣保藏，則未檢測到顯著的ATP分解。K值的測定目前通用的方法為高效液相分離。使用的分離體系一般為酸性磷酸緩沖液。研究發現，將樣品體系PH調節至3. 0后，在濾液中添加pH7. 5磷酸緩沖液可有效使抽提出的ATP及其關聯產物混合體系達到pH7. 0，用于預處理樣品的長期保存，有助于戶外采樣和樣品的批量處理。另外，在樣品預處理時經磷酸緩沖液處理，可有效防止預處理樣品中混有的蛋白質上柱后在酸性條件下沉淀，堵塞高效液相分離柱。綜上可見，本專利技術在傳統方法的基礎上省去勻漿，離心，調節pH，建立了一個簡單可行的方法。下面根據實施例詳細描述本專利技術，本專利技術的目的和效果將變得更加明顯。實施例1 : 取0. 8g魚肉，加入冷卻的5%高氯酸10mL，冰浴條件下混合物在50mL離心管中用玻璃棒擠壓攪拌15分鐘進行提取。在提取液中加入IM K0H，使pH為2. O。加蒸餾水清洗玻璃棒，至20mL。靜置30分鐘，取上清液通過0. 45 ii m微濾膜過濾，取濾液0. 8mL,加0. 2mL0.1M磷酸緩沖液(pH 7. 5)，·得到ImL HPLC樣品。實驗證明，本實例中通過以上預處理所得樣品經高效液相分離，圖譜清晰，重復性較高。實施例2: 取1. Og魚肉，加入冷卻的2. 5%高氯酸10mL，冰浴條件下混合物在50mL離心管中用玻璃棒擠壓攪拌20分鐘進行提取。在提取液中加入IM KOH,使pH為3. O。加去離子水清洗玻璃棒，至20mL。靜置30分鐘，取上清液通本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種魚類鮮度K值測定樣品前處理方法，其特征在于，包括以下步驟：（1）取0.8?1.2g左右魚肉樣品，放入容器中，添加質量濃度為2.5?10%的高氯酸的水溶液，魚肉樣品與高氯酸的水溶液的質量體積比為0.1（g/mL），在冰水浴條件下攪拌約10?20分鐘；（2）往容器中添加濃度為1M的KOH，調節pH值至2?3.5；（3）加蒸餾水或去離子水定容至20mL，通過0.45微米的微濾膜過濾除去可能含有的雜質；在濾液中添加0.2?1mL的濃度為0.1M、pH為7.5的磷酸緩沖液，即得到K值分析用的預處理樣品。

【技術特征摘要】
1.一種魚類鮮度K值測定樣品前處理方法，其特征在于，包括以下步驟(1)取O.8-1. 2g左右魚肉樣品，放入容器中，添加質量濃度為2. 5-10%的高氯酸的水溶液，魚肉樣品與高氯酸的水溶液的質量體積比為O.1 (g/mL)，在冰水浴條件下攪拌約10-20 分鐘...

【專利技術屬性】
技術研發人員：胡亞芹，劉東紅，陳士國，葉興乾，陳健初，張佳琪，丁甜，吳丹，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：發明
國別省市：