一種測定生物樣品中糖復合物含量的新方法技術

由于缺少靈敏適用范圍廣的檢測方法,糖復合在生物樣品中的檢測和示蹤方法,已成為其藥代動力學研究中的瓶頸問題。本發明專利技術是關于,包括糖蛋白、多糖、糖脂的含量測定方法。通過制備糖復合物的碘代衍生物后，以ICP?MS測定其在生物樣品中碘的含量，再根據糖復合物中的碘含量，計算出測定樣品種糖復合物的含量，為集成創新方法。該方法靈敏度高、結果準確、操作簡單、無放射性污染、適用范圍廣。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及糖復合物(多糖、糖蛋白、糖脂)在生物樣品中簡單、靈敏、準確、無放射性污染、適用范圍廣泛的檢測和示蹤方法。屬于藥物分析

技術介紹
糖復合物是生物體內除蛋白質和核酸以外的又一類重要的生物大分子，具有多種多樣的生物學功能，它幾乎沒有小分子化合物具有的異化生物代謝毒性，使用比較安全，和其他藥物的相互作用比較少。由于其上述特點和對許多目前缺少治療藥物的疾病具有良好的前景，已成為生命科學研究和新藥開發中極受重視的一類化合物。但是，由于其結構十分復雜，分離純化困難，缺少簡單、靈敏的檢測方法，其生物利用度和藥代動力學的研究十分困難，嚴重制約了其研究和開發。生物利用度和藥代動力學是借助動力學原理對藥物的吸收、分布、代謝和排除(ADME)過程進行研究。它是集中藥理學、藥物化學、分析化學、數學等學科于一體的邊緣學科。它承擔著闡明藥物作用機制和科學內涵；設計及優選給藥方案；促進新藥開發劑型優選和質量控制；在藥物的研發、應用中具有重要的作用和位置。糖復合物的生物利用度和藥代動力學的研究相對困難，主要原因是缺少理想的在生物樣品中的檢測方法。目前糖復合物生物樣品中的檢測方法主要有：色譜法、放射性同位素標記法、熒光測定法和生物測定法。由于糖類結構及其在體內代謝的特點，其樣品和代謝產物是一組結構和分子量近似的化合物。色譜法、生物法、熒光標記法對糖類化合物的藥代動力學研究，或因為檢測方法靈敏度不高、干擾強或因生物樣品處理困難、對測定結果影響嚴重等原因，使其應用受到嚴重限制。同位素標記法應用的較多，該方法的靈敏度高、適用范圍廣，應用較多。但是該方法對實驗條件要求苛刻和成本高、易造成放射性污染。尋找和建立簡單、方便的示蹤和測定方法，是在糖復合物藥代動力學，包括生物利用度研究中的關鍵技術，也是糖復合物研究中亟待解決的關鍵科學問題之一。糖蛋白因其含有胺基或酪氨酸可同碘發生取代反應，對于不含有胺基的糖復合物,可通過制備它的熒光素衍生物后,再進行碘代反應,生成穩定的、對糖類結構影響較小的碘代化合物。在同位素標記法進行糖的藥代動力學研究中,以碘的放射性同位素對糖復合物進行標記是經典和適用的方法。電感耦合等離子體質譜(Inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)，是近年發展起來的新的分析測試技術。它不僅可以取代傳統的無機分析技術如電感耦合等離子體光譜技術、石墨爐原子吸收等,進行定性、定量分析及同位素比值的準確測量等,還可檢測上述方法難以檢測的元素，如鹵族元素；同時它還可以與其他技術如HPLC、HPCE、GC聯用進行元素的形態、分布特性等的分析，具有靈敏度高、結果穩定的特點。將碘代多糖與ICP-MS檢測技術相結合，集成創新，有望建立一種新的簡單、方便、可靠、適用范圍廣的糖復合物示蹤和測定方法。本專利技術完成前未發現有關碘代糖復合物與ICP-MS相結合測定生物樣品中糖復合物含量的報道，本專利技術具有廣泛的應用前景。
技術實現思路
本專利技術的目的之一是制備碘代糖復合物.根據糖復合物化學性質的不同,進行不同的取代反應.一、對于含有絡氨酸糖復合物,直接通過化學反應，以共價鍵與碘連接，生成碘代糖復合物。該反應可通過氯胺T催化，直接進行碘的取代反應，生成碘代多糖.二、對多糖、糖脂類不含有可同碘直接發生取代反應的成分，首先制備其與熒光素的衍生物，再將碘與熒光素反應，制備碘-熒光素-多糖復合物。本專利技術的目的之二是以電感耦合等離子體質譜(Inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)測定碘代糖復合物的含量。ICP-MS是近年發展起來的新的分析測試技術。它不僅可以取代傳統的無機分析技術如電感耦合等離子體光譜技術、石墨爐原子吸收等,進行定性、定量分析及同位素比值的準確測量等,還可檢測上述方法難以檢測的元素，如鹵族元素；同時它還可以與其他技術如HPLC、HPCE、GC聯用進行元素的形態、分布特性等的分析，具有靈敏度高、結果穩定的特點。本專利技術是根據測定的碘含量，計算各樣品中糖復合物的含量。將碘代多糖與ICP-MS檢測技術相結合，建立新的生物樣品中測定多糖含量的方法，為集成創新，該方法是簡單、方便、可靠、適用范圍廣的糖復合物的示蹤和測定方法，具有實質的突出特點和顯著的技術進步。具體操作為：1、一種測定生物樣品中多糖含量的新方法,所述的方法為：(1)糖蛋白中含有游離胺基，在催化劑的催化下，游離胺基中的氫可被碘取代，生成碘代多糖，具體操作方法為：取糖蛋白樣品0.2g，以水5ml溶解，以氯胺T為催化劑，加入濃度為0.5mol/L的碘化鉀碘1ml，進行碘代反應，反應產物經凝膠柱層析純化，收集糖蛋白類化合物部分，冷凍干燥得到碘代糖蛋白；(2)對于不含有游離氨基的多糖、糖脂，可首先制備它們與熒光素的衍生物，再與碘進行取代反應，具體操作方法為：取樣品1g，溶解二甲基亞砜在10ml中，加吡啶10滴，加入熒光素0.1g，再加入二月桂酸二丁基錫20mg，95℃混合加熱2小時，加入無水乙醇50mL，放置,傾去上清,以乙醇反復清洗,洗去多余的染料，離心，得熒光素-多糖復合物，該復合物按照步驟(1)中所述進行碘代反應，制得碘代多糖或碘代糖脂；(3)由步驟(1)或者(2)所制備的糖復合物的碘代產物，進行動物或細胞實驗，收集需測定的樣品，經消化后，以ICP-MS測定樣品中碘的含量，根據樣品中碘的標記量，換算成各樣品中糖復合物的含量。下面以銀耳糖蛋白為例對本專利技術測定方法的具體內容進行詳細說明。由于無市售樣品可用，我們需自制銀耳糖蛋白，作為研究的樣品。糖復合物包含糖蛋白、多糖和糖脂。糖蛋白均含有一定量的絡氨酸，可同碘直接發生取代反應；多糖和糖脂由于不含有可同碘直接發生反應的基團，需制成可同碘發生取代反應的衍生物后，與碘反應生成碘代衍生物。生成的碘代糖復合物，測定碘含量后，進行動物或細胞實驗，制備需要的生物樣品；經消解后，以ICP-MS測定其中碘的含量，根據樣品中碘含量，計算樣品中糖復合物的含量。一.碘代糖蛋白-的制備1.銀耳糖蛋白的制備 我們以前的研究表明，采用適當的方法，可由銀耳制備銀耳糖蛋白，解決無合適商品試劑的問題。因此糖蛋白以銀耳多糖復合物為代表.制備方法為:取銀耳孢糖一公斤，加入5倍量純水，加溫至70℃，攪拌2小時，離心(3000rpm,10min.),收集上清液，減壓蒸發至700ml，攪拌下加無水乙醇4000ml，靜置過夜后離心，收集沉淀部分，冷凍干燥。粗制銀耳糖蛋白經Sephadex G-100中壓凝膠柱層析，收集分子量1萬的部分，濃縮，凍干，得到銀耳糖蛋白。2.銀耳糖蛋白樣品的分析 干燥后的樣品中總糖、糖醛酸、蛋白質分別以苯酚-硫酸法、間羥二酚法、Lowery法測定，甘露糖、葡萄糖醛酸和牛血清白蛋白為標準品，結果表明其中總糖的含量為80.2％，糖醛酸含量為6.5％，蛋白質含量為7.8％；分子量分布以HPGPC法測定，以系列右旋糖酐為分子量對照品，OHPAK-SB804HQ色譜柱，RID-10A檢測器，流動相為0.7％的硫酸鈉溶液，結果通過GPC軟件計算，銀耳多糖復合物的峰位分子量為10.23KDa；組成糖分析采用PMP衍生化法，根據各標準單糖和樣品衍生物的保留本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種測定生物樣品中多糖含量的新方法,所述的新方法為：(1)糖蛋白中含有游離胺基，在催化劑的催化下，游離胺基中的氫可被碘取代，生成碘代多糖，具體操作方法為：取糖蛋白樣品0.2g，以水5ml溶解，以氯胺T為催化劑，加入濃度為0.5mol/L的碘化鉀碘1ml，進行碘代反應，反應產物經凝膠柱層析純化，收集糖蛋白類化合物部分，冷凍干燥得到碘代糖蛋白；(2)對于不含有游離氨基的多糖、糖脂，可首先制備它們與熒光素的衍生物，再與碘進行取代反應，具體操作方法為：取樣品1g，溶解二甲基亞砜在10ml中，加吡啶10滴，加入熒光素0.1g，再加入二月桂酸二丁基錫20mg，95℃混合加熱2小時，加入無水乙醇50mL，放置,傾去上清,以乙醇反復清洗,洗去多余的染料，離心，得熒光素?多糖復合物，該復合物按照步驟(1)中所述進行碘代反應，制得碘代多糖或碘代糖脂；(3)由步驟(1)或者(2)所制備的糖復合物的碘代產物，進行動物或細胞實驗，收集需測定的樣品，經消化后，以ICP?MS測定樣品中碘的含量，根據樣品中碘的標記量，換算成各樣品中糖復合物的含量。

【技術特征摘要】
1.一種測定生物樣品中多糖含量的新方法,所述的新方法為：(1)糖蛋白中含有游離胺基，在催化劑的催化下，游離胺基中的氫可被碘取代，生成碘代多糖，具體操作方法為：取糖蛋白樣品0.2g，以水5ml溶解，以氯胺T為催化劑，加入濃度為0.5mol/L的碘化鉀碘1ml，進行碘代反應，反應產物經凝膠柱層析純化，收集糖蛋白類化合物部分，冷凍干燥得到碘代糖蛋白；(2)對于不含有游離氨基的多糖、糖脂，可首先制備它們與熒光素的衍生物，再與碘進行取代反應，具體操作方法為：取樣品1g，溶...

【專利技術屬性】
技術研發人員：高陽，李紅月，徐多多，王明星，高其品，
申請(專利權)人：高其品，
類型：發明
國別省市：吉林;22