尿液中肺癌特征代謝產物指紋圖譜的檢測方法技術

本發明專利技術公開了一種尿液中肺癌特征代謝產物指紋圖譜的檢測方法，采用氣相色譜質譜聯用技術檢測肺癌患者和健康對照者的尿液樣本的代謝圖譜，結合支持向量機的生物學方法，分別建立吸煙者肺癌代謝產物指紋圖譜和非吸煙者肺癌代謝產物指紋圖譜；吸煙者肺癌代謝產物指紋圖譜由草酸、磷酸、尿嘧啶、蘇氨酸、5-氧脯氨酸、檸檬酸和半乳糖組成或者由磷酸、尿酸、檸檬酸和草酸組成；非吸煙者肺癌代謝產物指紋圖譜由丙氨酸、草酸、磷酸、尿嘧啶、絲氨酸、蘇氨酸、5-氧脯氨酸、核糖、順烏頭酸、檸檬酸、半乳糖、酪氨酸、軟脂酸和硬脂酸組成。該方法僅需要尿液樣本即可進行檢測，操作方面滿足了有效性和簡單易行的要求，非常適合于大規模應用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及尿液檢測領域，具體涉及一種。
技術介紹
肺癌是最常見的肺原發性惡性腫瘤，絕大多數肺癌起源于支氣管粘膜上皮，故亦稱支氣管肺癌，是世界上發病率及死亡率最高的腫瘤。其總體5年生存率在美國約為15%，在中國及歐洲國家約為8%。然而晚期的遠處轉移病例的5年生存率僅為2%。當前主要的治療手段為早期發現、早期治療。肺癌的發生發展通常較隱匿，7%-10%的病例可沒有臨床表現，發現時已經為晚期。目前仍缺乏一種簡單、有效的方法用于篩查肺癌。工業廢氣、建筑揚塵、生活燃料和油煙，交通廢氣等空氣污染，以及卷煙煙氣等都是認定為肺癌重要的危險因素。吸煙與肺癌也是密切相關的，在發達國家吸煙者患肺癌的相對危險度較非吸煙者高5-10倍，在一篇中國的相關報道中顯示吸煙的相對危險度約為2-4 (Bo-Qi Liu，et，al.Emergingtobacco hazards in China:1. Retrospective proportional mortality studyof onemillion deaths. BMJ 317:1411.)。當前，全球有13億的煙民，且在世界范圍，煙草的消費仍然處于一種上升的趨勢，特別是在中低收入的發展中國家。我國是煙草生產和消費大國，預計在未來的一段時間里，我國吸煙人數還將大幅上升。因而預防吸煙有關的肺癌，有十分重要的意義。肺癌的主要治療依賴于早期診斷和治療，而當前并沒有一種便捷、有效的方法用來對肺癌進行篩查。氣相色譜質譜聯用技術(GC/MS)現已被廣泛的應用于復雜組分的分離和鑒定，其結合了氣相色譜的高分辨率和質譜的高靈敏度，是生物樣品中藥物與代謝物定性定量的有效工具。GC/MS和液相色譜質譜聯用技術(LC/MS)當前也被廣泛的應用到代謝組學的研究中。色譜技術主要由流動相和固定相組成，樣本由流動相帶入色譜儀，在氣相色譜技術中，流動相即為氣體。當兩相作相對運動時，樣本不斷地在兩相之間進行分配，樣本各組分與固定相分子間發生吸附、溶解、結合或離子交換，使樣本各組分隨載氣在兩相之間反復多次分配，由于樣本各組分之間的性質不同，流動相氣體攜帶的樣本中各種不同組分在色譜過程中的樣本中表現出不同的色譜行為，最終使那些分配系數只有微小差別的組分發生很大的分離效果，從而使不同組分得到完全分離。將分離后的各種組分用質譜進行檢測。并對檢測后得到的代謝產物進行對比分析，最后得到各組間的差異性代謝產物，利用支持向量機、人工神經網絡及主成分分析等生物信息學的方法選擇部分差異性代謝產物建立判別模型。
技術實現思路
本專利技術提供了一種，采用氣相色譜質譜聯用技術(GC / MS)，從代謝組學研究的角度篩選可用于篩查吸煙人群和非吸煙人群中肺癌患病狀況的生物標志物。一種，采用氣相色譜質譜聯用技術檢測肺癌患者和健康對照者的尿液樣本的代謝圖譜，結合支持向量機的生物學方法，分別建立吸煙者肺癌代謝產物指紋圖譜和非吸煙者肺癌代謝產物指紋圖譜；吸煙者肺癌代謝產物指紋圖譜由草酸、磷酸、尿嘧啶、蘇氨酸、5-氧脯氨酸、檸檬酸和半乳糖組成或者由磷酸、尿酸、檸檬酸和草酸組成；非吸煙者肺癌代謝產物指紋圖譜由丙氨酸、草酸、磷酸、尿嘧啶、絲氨酸、蘇氨酸、5-氧脯氨酸、核糖、順烏頭酸、檸檬酸、半乳糖、酪氨酸、軟脂酸和硬脂酸組成。所述的吸煙者肺癌代謝產物指紋圖譜中的顯著特征為磷酸、尿酸、檸檬酸和草酸。所述的非吸煙者肺癌代謝產物指紋圖譜中的顯著特征為尿嘧啶。具體實驗步驟如下采用氣相色譜質譜聯用技術對肺癌人群和健康對照人群的尿液樣本進行檢測，確定代謝產物圖譜；1.通過生物信息學的方法，分別找到吸煙和非吸煙人群中的肺癌和健康對照的差異性代謝產物，并建立預測模型；2.通過對吸煙人群和非吸煙人群的兩組尿液代謝產物的對比，找到了與吸煙和肺癌同時相關的代謝產物，包括磷酸、尿酸、檸檬酸和草酸；3.用建立的預測模型對肺癌人群和健康對照人群進行檢測，3組的準確率分別為吸煙人群91. 67%, 83. 87% ;非吸煙人群:90. 70%, 66. 67% ;總人群89. 87%, 73. 47%。所述的氣相色譜質譜聯用技術的參數設置包括進樣口溫度270°C ±5°C ;無分流進樣；載氣氦氣；載氣流速1. OmL/min ;升溫程序柱始溫85°C ±5°C保持5min± lmin,以8°C /min 程序升溫至 125°C ±5°C保持 7min±lmin，以 10°C /min 程序升溫至 190°C ±5°C保持 10min±lmin,以 10°C /min 程序升溫至 300°C ±5°C保持 5min±lmin。所述的尿液樣本預處理后采用氣相色譜質譜聯用技術檢測，所述的尿液樣本預處理的方法包括取尿液樣本，加入脲酶水溶液,混合均勻并水浴孵育后加入內標戊五醇水溶液和丙酮，充分混勻后離心分離，吸取上清液離心濃縮揮干溶劑，再加入甲氧胺吡啶溶液，混勻后于65°C _75°C下肟化0. 9h-l. lh，然后加衍生化試劑，混勻后靜置，最后加入正庚烷，混勻后離心，吸取上清液供氣質分析；所述的衍生化試劑為N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷。所述的尿液樣本、脲酶水溶液、戊五醇水溶液和丙酮的體積比為1:0.08-0. 12 0. 08-0. 12 :1. 8-2. 2，進一步優選為 1:0.1 0.1 :2。所述的脲酶水溶液的濃度優選為80mg/ml ;所述的戊五醇水溶液的濃度優選為0. 3mg/ml o所述的N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷的體積比為100:1。所述的得到的代謝產物指紋圖譜可作為肺癌檢測和篩查的中間信息應用于肺癌檢測和篩查中。與現有技術相比，本專利技術具有如下優點本專利技術發現了兩組代謝產物，分別針對吸煙者和非吸煙者建立了肺癌篩查的預測模型，有較高的敏感性和特異性，且僅需要尿液樣本即可進行檢測，操作方面滿足了有效性和簡單易行的要求，非常適合于實際應用。本專利技術采用了氣相色譜質譜聯用技術(GC / MS)及支持向量機等生物信息學方法。在使用本專利技術時，首先應當根據測試對象是否吸煙后，選擇相應的模型，采用氣質聯用的方法對測試對象的尿液進行檢測，得到的代謝產物指紋圖譜可作為肺癌檢測和篩查的中間信息應用于肺癌檢測和篩查中。附圖說明圖1應用于總人群的模型的準確率；圖2應用于吸煙人群的模型的準確率；圖3應用于非吸煙人群的模型的準確率。圖中，intensity為強度，SVM result scatter plot為支持向量機預測散點分布圖，principal component為主成分，SVM predict labels為支持向量機預測標簽；Group0為健康對照組，Group I為肺癌患者組。具體實施例方式本專利技術將結合具體實施例作進一步說明，這些實施例僅用于說明本專利技術的目的，而不用于限制本專利技術范圍。實施例1尿液的檢測方法移取尿液樣本IOOii I于1. 5ml離心管中，加入IOu I脲酶(用于去除尿液中的尿素，尿素可干擾尿液中其他的水溶性代謝產物脫水和衍生化)水溶液(8 0 m g / m I )，混合均勻后于37°C水浴孵育2小時以去除尿液中含有的尿素，加入內標IOii L戊五醇水溶液(0. 3mg/ml)和200 ii L丙酮，渦旋lmin，本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種尿液中肺癌特征代謝產物指紋圖譜的檢測方法，其特征在于，采用氣相色譜質譜聯用技術檢測肺癌患者和健康對照者的尿液樣本的代謝圖譜，結合支持向量機的生物學方法，分別建立吸煙者肺癌代謝產物指紋圖譜和非吸煙者肺癌代謝產物指紋圖譜；吸煙者肺癌代謝產物指紋圖譜由草酸、磷酸、尿嘧啶、蘇氨酸、5?氧脯氨酸、檸檬酸和半乳糖組成或者由磷酸、尿酸、檸檬酸和草酸組成；非吸煙者肺癌代謝產物指紋圖譜由丙氨酸、草酸、磷酸、尿嘧啶、絲氨酸、蘇氨酸、5?氧脯氨酸、核糖、順烏頭酸、檸檬酸、半乳糖、酪氨酸、軟脂酸和硬脂酸組成。

【技術特征摘要】
1.一種尿液中肺癌特征代謝產物指紋圖譜的檢測方法，其特征在于，采用氣相色譜質譜聯用技術檢測肺癌患者和健康對照者的尿液樣本的代謝圖譜，結合支持向量機的生物學方法，分別建立吸煙者肺癌代謝產物指紋圖譜和非吸煙者肺癌代謝產物指紋圖譜；吸煙者肺癌代謝產物指紋圖譜由草酸、磷酸、尿嘧啶、蘇氨酸、5-氧脯氨酸、檸檬酸和半乳糖組成或者由磷酸、尿酸、檸檬酸和草酸組成；非吸煙者肺癌代謝產物指紋圖譜由丙氨酸、草酸、磷酸、尿嘧啶、絲氨酸、蘇氨酸、5-氧脯氨酸、核糖、順烏頭酸、檸檬酸、半乳糖、酪氨酸、軟脂酸和硬脂酸組成。2.根據權利要求1所述的尿液中肺癌特征代謝產物指紋圖譜的檢測方法，其特征在于，所述的氣相色譜質譜聯用技術的參數設置包括進樣口溫度270°C ±5°C ;無分流進樣；載氣氦氣；載氣流速1. OmL/min ;升溫程序柱始溫85°C ±5°C保持5min±lmin,以8°C /min程序升溫至125°C ±5°C保持7min±lmin,以10°C /min程序升溫至190°C ±5°C保持10min±lmin,以 10°C /min 程序升溫至 300°C ±5°C保持 5min±lmin。3.根據權利要求1所述的尿液中肺癌特征代謝產物指紋圖譜的檢測方法，其特征在于，所述的尿液樣本預處理后采用氣相色譜質譜聯用技術檢測，所述的尿液樣本預處理的方法包括取尿液樣本，加入脲酶水溶液，混合均勻并...

【專利技術屬性】
技術研發人員：儲國海，周國俊，黃芳芳，余捷凱，胡集祎，鄭樹，范驍輝，陸曉燕，
申請(專利權)人：浙江中煙工業有限責任公司，
類型：發明
國別省市：