基于時(shí)間分辨化學(xué)發(fā)光的多元免疫分析方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了基于時(shí)間分辨化學(xué)發(fā)光的多元免疫分析方法，包括以下步驟，用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)不同的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物分別標(biāo)記不同的抗原或抗體，然后與待測(cè)物同時(shí)加入包被有相應(yīng)抗體或抗原的酶標(biāo)板反應(yīng)孔中進(jìn)行免疫反應(yīng)；再向所述反應(yīng)孔中加入引發(fā)化學(xué)發(fā)光的共反應(yīng)劑，最后在不同時(shí)間窗口分別檢測(cè)不同的化學(xué)發(fā)光信號(hào)；利用該方法，通過時(shí)間分辨在不同的時(shí)間窗口分別檢測(cè)不同組分的化學(xué)發(fā)光信號(hào)，以實(shí)現(xiàn)不同組分的免疫分析，無(wú)需使用精密的熒光壽命測(cè)量系統(tǒng)，只需采用常規(guī)化學(xué)發(fā)光分析儀和普通計(jì)時(shí)工具即可完成多組分的檢測(cè)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及化學(xué)發(fā)光免疫分析領(lǐng)域，特別涉及。
技術(shù)介紹
化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)是將化學(xué)發(fā)光分析與免疫反應(yīng)結(jié)合起來(lái)建立的方法，它既具有化學(xué)發(fā)光分析的高靈敏度，又具有免疫分析的高特異性。早在1977年，Halman等就創(chuàng)建了 CLIA，并用于檢測(cè)抗原或抗體。由于CLIA具有靈敏度高、檢測(cè)范圍寬、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)迅速，并且容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)，替代了放射性同位素，避免了放射性污染等優(yōu)勢(shì)，在臨床診斷、環(huán)境檢測(cè)、食品安全等領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。隨著免疫分析技術(shù)的高速發(fā)展，對(duì)單一組分的檢測(cè)往往不能滿足對(duì)復(fù)雜生物樣品檢測(cè)的實(shí)際需要，多組分免疫分析的出現(xiàn)引起了人們的廣泛關(guān)注。目前，已有的多組分免疫分析方法主要可歸為兩大類陣列模式和多標(biāo)記物模式。陣列模式通常是在免疫反應(yīng)器的不同陣列區(qū)域來(lái)實(shí)現(xiàn)多個(gè)組分的同時(shí)檢測(cè)，如采用陣列芯片或傳感器陣列。該方法需要復(fù)雜的儀器做支撐，并且通常需采用昂貴的陣列型檢測(cè)器，如C⑶和多通道電化學(xué)工作站。多標(biāo)記物模式是另一種常見的多組分免疫分析模式，其基本原理是以不同的信號(hào)探針標(biāo)記不同組分，通過識(shí)別不同探針的信號(hào)來(lái)檢測(cè)不同組分如在光譜法中以波長(zhǎng)識(shí)別，電化學(xué)法中以電位識(shí)別，質(zhì)譜法中以荷質(zhì)比識(shí)別，放射法中以射線能量識(shí)別。時(shí)間分辨突光多組分免疫分析是一種典型的基于多標(biāo)記物模式的技術(shù)，該技術(shù)米用具有不同熒光壽命的稀土金屬配合物作為探針，分別標(biāo)記不同組分，然后通過熒光壽命的差異在不同時(shí)間窗口實(shí)現(xiàn)不同組分的檢測(cè)。由于熒光壽命短，利用時(shí)間分辨熒光需要精密的熒光壽命測(cè)量系統(tǒng)，價(jià)格昂貴。化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中存在著類似現(xiàn)象，很多化學(xué)發(fā)光反應(yīng)有著截然不同的動(dòng)力學(xué)特征有的是閃光型化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，即信號(hào)迅速達(dá)到峰值，之后迅速衰減，發(fā)光時(shí)間很短，只有零點(diǎn)幾秒到幾秒；有的是輝光型化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，即發(fā)光試劑混合時(shí)初始發(fā)光信號(hào)極低，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)發(fā)光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，發(fā)光時(shí)間從幾分鐘到幾十分鐘，或幾小時(shí)至更久；有的還是震蕩反應(yīng)，即隨時(shí)間變化，化學(xué)發(fā)光信號(hào)發(fā)生周期性增強(qiáng)和衰減。但是，目前尚未見到有報(bào)道將這種現(xiàn)象用于化學(xué)發(fā)光免疫分析，以實(shí)現(xiàn)多種組分的免疫測(cè)定。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的之一在于提供，以實(shí)現(xiàn)通過時(shí)間分辨化學(xué)發(fā)光的多組分。為實(shí)現(xiàn)上述專利技術(shù)目的，技術(shù)方案為 ，包括如下步驟 (I)用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)不同的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物分別標(biāo)記不同的抗原或抗體，然后與待測(cè)物同時(shí)加入包被有相應(yīng)抗體或抗原的酶標(biāo)板反應(yīng)孔中進(jìn)行免疫反應(yīng)； (2)向所述反應(yīng)孔中加入引發(fā)化學(xué)發(fā)光的共反應(yīng)劑，然后在不同時(shí)間窗口分別檢測(cè)不同的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。本專利技術(shù)中，由于不同的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物具有不同的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，因此加入共反應(yīng)劑后在不同的時(shí)間窗口呈現(xiàn)出不同組分的光信號(hào)。優(yōu)選的，所述步驟(I)是用閃光型化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物和輝光型化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物分別標(biāo)記不同的抗原或抗體，然后與待測(cè)物同時(shí)加入包被有相應(yīng)抗體或抗原的酶標(biāo)板反應(yīng)孔中進(jìn)行免疫反應(yīng)。優(yōu)選的，所述步驟(I)是用辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶分別標(biāo)記克倫特羅和萊克多巴胺，然后與克倫特羅和萊克多巴胺同時(shí)加入到包被有克倫特羅抗體和萊克多巴胺抗體的酶標(biāo)板反應(yīng)孔中進(jìn)行免疫反應(yīng)。優(yōu)選的，所述包被的具體方法為將克倫特羅抗體和萊克多巴胺抗體溶解于O. 10M pH 8.0 Tris-HCl緩沖液中至克倫特羅抗體濃度為8. O Pg/mL，萊克多巴胺抗體的濃度為10.0 Pg/mL，混勻，得包被液；然后將包被液加入到聚苯乙烯酶標(biāo)板，然后置于4 °C條件下包被過夜，倒去孔中未結(jié)合的抗體溶液，然后每孔用洗液清洗，再向每個(gè)孔中加入封閉緩沖液，在37 °C下封閉1. 5小時(shí)，將酶標(biāo)板用洗液清洗3次。優(yōu)選的，所述共反應(yīng)劑含有魯米諾，對(duì)碘苯酚，H2O2和堿性磷酸酶底物液。優(yōu)選的，所述共反應(yīng)劑含有1. OXlO-4 M的魯米諾、5. OXlO-6 M的對(duì)碘苯酚、IOmM的H2O2和25 mM的堿性磷酸酶底物液。更優(yōu)選的，所述共反應(yīng)劑的加入方式為先加入魯米諾和對(duì)碘苯酚，再加入H2O2與ALP底物液的混合物，所述H2O2與堿性磷酸酶底物液體積比為1:1。優(yōu)選的，所述共反應(yīng)劑的pH值為9. O。本專利技術(shù)中閃光型化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的發(fā)光時(shí)間很短，只有零點(diǎn)幾秒到幾秒；輝光型又稱持續(xù)型，發(fā)光時(shí)間從幾分鐘到幾十分鐘，或幾小時(shí)至更久。本專利技術(shù)的有益效果本專利技術(shù)公開的，與傳統(tǒng)的多標(biāo)記物模式的分光光度法和常規(guī)熒光法相比，無(wú)需采用分光系統(tǒng)以分辨不同組分所發(fā)出不同波長(zhǎng)的光信號(hào)；與時(shí)間分辨熒光法相比，化學(xué)發(fā)光法的時(shí)間窗口更寬前者的時(shí)間窗口在毫秒級(jí)，而后者的時(shí)間窗口從秒級(jí)到小時(shí)級(jí)不等，因此為發(fā)光信號(hào)的時(shí)間分辨提供了更為便利的條件，無(wú)需采用復(fù)雜的熒光壽命測(cè)量系統(tǒng)，如基于時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)技術(shù)的精密測(cè)量系統(tǒng)，只需用秒表、時(shí)鐘等最為常見的計(jì)時(shí)工具分辨信號(hào)；與采用陣列模式的多組分免疫分析法相比，儀器化程度低，操作簡(jiǎn)便，只需常規(guī)的化學(xué)發(fā)光分析儀即可，無(wú)需其常用的復(fù)雜儀器設(shè)備以及昂貴的陣列型檢測(cè)器，因而成本較低。附圖說明圖1為本專利技術(shù)的基于時(shí)間分辨的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的示意圖。圖2為本專利技術(shù)檢測(cè)克倫特羅和萊克多巴胺的工作曲線。具體實(shí)施例方式為了使本專利技術(shù)的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面對(duì)本專利技術(shù)的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例1 結(jié)合附圖1對(duì)基于時(shí)間分辨化學(xué)發(fā)光的多元免疫分析法做進(jìn)一步詳細(xì)的說明。在實(shí)施例中，以克倫特羅(CLE)和萊克多巴胺(RAC)作為模型分析物，辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)作為化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物分別標(biāo)記CLE和RAC，采用基于時(shí)間分辨化學(xué)發(fā)光的多元免疫分析法來(lái)檢測(cè)不同的“瘦肉精”類物質(zhì)。本專利技術(shù)采用競(jìng)爭(zhēng)免疫模式，具體免疫分析步驟如下 首先將CLE抗體和RAC抗體溶解于O. 10 M pH 8. O Tris-HCl緩沖液中混合后作為包被液，至CLE抗體濃度為8. O Pg/mL，RAC抗體的濃度為10. O Pg/mL，然后將包被液加入到高親和力的聚苯乙烯96孔酶標(biāo)板，每孔加入100 UL包被液，然后置于4 °C條件下包被過夜，倒去孔中未結(jié)合的抗體溶液，然后每孔用300 μ L的洗液(含體積分?jǐn)?shù)為O. 05%吐溫20的Tris-HCl緩沖溶液)清洗3次，再向每個(gè)孔中加入150 μ L的封閉緩沖液(SuperBlOck T20， Thermo Fisher Scientific Inc.)在37 °C下封閉1. 5小時(shí),將酶標(biāo)板用洗液清洗3次；然后，在每個(gè)孔中依次加入80 μ L含有不同濃度的CLE和RAC的樣品溶液，同時(shí)加入含有HRP標(biāo)記的CLE抗原(10 Pg/mL)和ALP標(biāo)記的RAC抗原(20 Pg/mL)各10 μ L，繼續(xù)在37 °〇下孵育1. 5 h，使其充分地發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性免疫結(jié)合。孵育結(jié)束后清洗酶標(biāo)板，待進(jìn)一步檢測(cè)。在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)過程中，通過注入共反應(yīng)劑同時(shí)觸發(fā)兩個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。共反應(yīng)劑包括魯米諾，對(duì)碘苯酚，H2O2和ALP底物液。加入方式為先每孔分別加入40 μ L濃度為1.OX 10_4 M的魯米諾和20 μ L濃度為5. OX 10_6 M的對(duì)碘苯酚，然后將觸發(fā)兩個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的觸發(fā)劑10 mM的H2O2與25 mM的ALP底物液按1:1的比例混合，取30 μ 立即注入到待檢測(cè)的微孔中觸發(fā)反應(yīng)，通過光電倍增管收集化學(xué)發(fā)光信號(hào)，光電倍增管本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
基于時(shí)間分辨化學(xué)發(fā)光的多元免疫分析方法，其特征在于，包括如下步驟：（1）用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)不同的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物分別標(biāo)記不同的抗原或抗體，然后與待測(cè)物同時(shí)加入包被有相應(yīng)抗體或抗原的酶標(biāo)板反應(yīng)孔中進(jìn)行免疫反應(yīng)；（2）向所述反應(yīng)孔中加入引發(fā)化學(xué)發(fā)光的共反應(yīng)劑，然后在不同時(shí)間窗口分別檢測(cè)不同的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。

【技術(shù)特征摘要】
1.基于時(shí)間分辨化學(xué)發(fā)光的多元免疫分析方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)不同的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物分別標(biāo)記不同的抗原或抗體，然后與待測(cè)物同時(shí)加入包被有相應(yīng)抗體或抗原的酶標(biāo)板反應(yīng)孔中進(jìn)行免疫反應(yīng)； (2)向所述反應(yīng)孔中加入引發(fā)化學(xué)發(fā)光的共反應(yīng)劑，然后在不同時(shí)間窗口分別檢測(cè)不同的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于時(shí)間分辨化學(xué)發(fā)光的多元免疫分析方法，其特征在于所述步驟(I)是用閃光型化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物和輝光型化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物分別標(biāo)記不同的抗原或抗體，然后與待測(cè)物同時(shí)加入包被有相應(yīng)抗體或抗原的酶標(biāo)板反應(yīng)孔中進(jìn)行免疫反應(yīng)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于時(shí)間分辨化學(xué)發(fā)光的多元免疫分析方法，其特征在于所述步驟(I)是用辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶分別標(biāo)記克倫特羅和萊克多巴胺，然后與克倫特羅和萊克多巴胺同時(shí)加入到包被有克倫特羅抗體和萊克多巴胺抗體的酶標(biāo)板反應(yīng)孔中進(jìn)行免疫反應(yīng)。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述基于時(shí)間分辨化學(xué)發(fā)光的多元免疫分析方法，其特征在于所述包被的具體方法為將克倫特羅抗體和萊克多巴胺抗體溶解于O. 10 M pH 8.0 Tris-H...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：付志鋒，韓靜，高鴻飛，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：西南大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：