本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種基于DNA功能化納米復(fù)合材料的電化學(xué)免疫傳感器。該電化學(xué)免疫傳感器是在基體電極上負載樹枝狀金屬后，再加入負載抗體標(biāo)記物的介孔材料，接著引入DNA雜交鏈，最后加入活性物質(zhì)后形成的。其制備包括以下步驟：1）制備基體材料；2）制備負載抗體標(biāo)記物的介孔材料；3）構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器。并公開了一種基于DNA功能化納米復(fù)合材料的電化學(xué)免疫傳感器在檢測毒素中的應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)基于多重信號放大的策略，構(gòu)建了一種高靈敏度、低檢測限的電化學(xué)免疫傳感器。通過利用DNA擴增技術(shù)的高擴增能力，電化學(xué)檢測的高靈敏性，與納米材料表面效應(yīng)放大信號等策略相結(jié)合，建立一種快速免疫分析方法，實現(xiàn)了對痕量毒素的檢測。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種基于DNA功能化納米復(fù)合材料的電化學(xué)免疫傳感器。
技術(shù)介紹
生物傳感器是生命物質(zhì)能感受規(guī)定的被測量并按照一定的轉(zhuǎn)換成可用輸出信號的器件或裝置，它是以固定化的生物材料作為敏感元件，與適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)換元件結(jié)合所構(gòu)成的一類傳感器。根據(jù)生物傳感器中分子識別元件即敏感元件可分為五類：酶傳感器、微生物傳感器、細胞器傳感器、組織傳感器和免疫傳感器。這五類傳感器所采用的敏感材料依次為酶、微生物個體、細胞器、動植物組織切片、免疫物質(zhì)。其中免疫傳感器由于操作簡單、靈敏度高、成本低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，其被應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測、臨床診斷、食品安全等領(lǐng)域。電化學(xué)免疫傳感器是以抗原或抗體為分子識別元件，通過抗原/抗體的特異性反應(yīng)，轉(zhuǎn)化器輸出與化學(xué)物質(zhì)濃度相關(guān)的電信號，來實現(xiàn)對待測物進行定量或半定量分析。電化學(xué)免疫傳感器主要有直接法、競爭法和夾心法這三種檢測方法。直接法是反應(yīng)液中抗原與抗體的結(jié)合引起的某些電化學(xué)性質(zhì)的變化來測試待測體系中抗原（抗體）的含量。競爭法分為直接競爭法和間接競爭法，其中間接競爭法是電極表面固定的抗原與待測體系的抗原競爭結(jié)合一抗，加入標(biāo)記的二抗來結(jié)合一抗，之后加入底物測量電信號的變化。夾心法是電極表面固定的抗體和待測抗原結(jié)合后，加入標(biāo)記的二抗結(jié)合待測抗原，之后測定加入底物后電信號的變化。功能化介孔材料由于比表面大、孔徑可調(diào)、表面存在大量活潑基團、很好的生物相容性和生物可降解性等優(yōu)點，在生物領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，特別在藥物緩釋研究和對大分子的固定方面。此外，介孔材料可以作為催化劑載體，將金屬、金屬氧化物等催化劑負載在介孔材料上。將具有熱力學(xué)穩(wěn)定的無機介孔材料與有機官能團的性質(zhì)相互結(jié)合，使材料多功能化，對其應(yīng)用更為廣泛。在生物分析和研究中，以核酸探針信號放大技術(shù)為基礎(chǔ)構(gòu)建的生物分子的分析方法受到廣泛關(guān)注。目前常見的核酸擴增方法有聚合酶鏈?zhǔn)?PCR)放大技術(shù)、鏈置換(SDA)放大技術(shù)、雜交鏈反應(yīng)(HCR)放大技術(shù)、滾環(huán)(RCA)放大技術(shù)及DNAzyme信號放大等。其中雜交鏈反應(yīng)是一種無酶信號的放大方式，利用核酸鏈之間的競爭雜交來實現(xiàn)信號的放大。這種方法由于可以在室溫下進行，且不需要其他酶的輔助，在生物傳感器中作為信號放大的檢測得到廣泛的應(yīng)用。在生物傳感器構(gòu)建中，信號放大是提高檢測靈敏度的重要方法，而脫氧核酶(DNAzyme)因其具有容易合成和化學(xué)穩(wěn)定性好等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用在催化某些化學(xué)反應(yīng)中。其中富G序列的探針與血紅素Hemin結(jié)合形成G-四鏈體-Hemin類DNA酶，G-平面的大共軛體系與hemin的Fe離子發(fā)生配位作用形成復(fù)合物，具有過氧化酶催化活性。由于G-四鏈體具有特殊的結(jié)構(gòu)及在生物體內(nèi)的重要性，推動了高效靈敏檢測傳感體系的構(gòu)建。雖然G-四鏈體-HeminDNA酶具有易于制備、價格較低等優(yōu)點，但跟天然辣根過氧化酶相比，其催化活性仍存在很大的差別。為了提高其在生化檢測傳感器的靈敏度，可以采用多級放大的方式，例如雜交鏈反應(yīng)反應(yīng)(HCR)。微囊藻毒素(Microcystins，MCs)是一類具有生物活性的環(huán)狀七肽化合物。由于組成的多肽中氨基酸種類可變，導(dǎo)致了微囊藻毒素種類的多樣，至今已發(fā)現(xiàn)80種以上的異構(gòu)體。在這些藻毒素中含量較大、毒性較大的有MC-LR、MC-RR、MC-YR等，其中L、R和Y分別代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸。而產(chǎn)生MC的藻類主要有銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)、魚腥藻(Anabaena)和顫藻(Oscillatoria)等。我國自20世紀(jì)60年代太湖開始爆發(fā)藍藻水華，之后黃河、長江及珠江中下游的很多湖泊也陸續(xù)出現(xiàn)不同程度的藍藻水華。水藻大量生長及死亡后會釋放藻毒素，而攝入含藻毒素的水體會嚴重危害人類的身體健康及其它生物的安全。因此，采取有效措施對微囊藻毒素進行及時準(zhǔn)確的檢測至關(guān)重要。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種基于DNA功能化納米復(fù)合材料的電化學(xué)免疫傳感器。本專利技術(shù)的技術(shù)方案如下：一種基于DNA功能化納米復(fù)合材料的電化學(xué)免疫傳感器，是在基體電極上負載樹枝狀金屬后，再加入負載抗體標(biāo)記物的介孔材料，接著引入DNA雜交鏈，最后加入活性物質(zhì)后形成的。所述的基體電極是碳電極、金屬電極中的其中一種。所述的樹枝狀金屬為貴金屬的其中一種。所述的負載抗體標(biāo)記物的介孔材料吸附有活性物質(zhì)。所述的活性物質(zhì)為二茂鐵、亞甲基藍、苯醌、血紅素中的至少一種。所述的介孔材料為改性的硅基介孔材料。所述的改性為氨基化、羧基化的其中一種。所述的一種基于DNA功能化納米復(fù)合材料的電化學(xué)免疫傳感器的制備，包括以下步驟：1）制備基體材料：在基體電極上用電沉積法合成樹枝狀金屬；2）制備負載抗體標(biāo)記物的介孔材料；用溶膠-凝膠法合成硅基介孔材料后進行改性，加入活性物質(zhì)后，再加入DNA引物和抗體制得；3）構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器：采用以上兩步所得的材料，通過間接競爭法，以及雜交鏈反應(yīng)引入DNA雜交鏈，最后加入活性物質(zhì)后制成的。所述的一種基于DNA功能化納米復(fù)合材料的電化學(xué)免疫傳感器在檢測毒素中的應(yīng)用。所述的毒素為微囊藻毒素。本專利技術(shù)的有益效果是：本專利技術(shù)基于多重信號放大的策略，構(gòu)建了一種高靈敏度、低檢測限的電化學(xué)免疫傳感器。通過利用DNA擴增技術(shù)的高擴增能力，電化學(xué)檢測的高靈敏性，與納米材料表面效應(yīng)放大信號等策略相結(jié)合，建立一種快速免疫分析方法，實現(xiàn)了對痕量毒素的檢測。具體如下：在電極表面沉積樹枝狀納米金，由于其比表面大，抗原的固定量增加，實現(xiàn)信號放大。在合成的功能化介孔二氧化硅納米材料上同時負載用于特異識別的二抗和DNA引物，并通過靜電作用將亞甲基藍嵌入介孔材料的孔道中。之后通過一種等溫、不用酶催化的DNA擴增技術(shù)—HCR，在輔助DNA序列的參與下，按順序依次形成帶有側(cè)鏈的雙螺旋DNA長鏈。加入氯化血紅素，合成G-qudruplex/heminDNA酶。最后加入亞甲基藍，亞甲基藍嵌入形成的DNA長鏈的凹槽中。合成的DNA酶在亞甲基藍的作用下，催化H2O2的還原。通過以上實驗步驟，實現(xiàn)了信號的五重放大，從而大大提高了檢測的靈敏度。附圖說明圖1是SiO2微球的TEM圖；圖2是氨基化的SiO2@MSN的TEM圖；圖3是氨基化SiO2@MSN吸附MB前(a)和后(b)的孔徑分布圖；圖4是樹枝狀A(yù)u的SEM圖；圖5是在PBS緩沖液和0.015MH2O2中不同組裝的免疫傳感器DPV響應(yīng)曲線。具體實施方式一種基于DNA功能化納米復(fù)合材料的電化學(xué)免疫傳感器，是在基體電極上負載樹枝狀金屬后，再加入負載抗體標(biāo)記物的介孔材料，接著引入DNA雜交鏈，最后加入活性物質(zhì)后形成的。優(yōu)選的，所述的基體電極是碳電極、金屬電極中的其中一種；進一步優(yōu)選的，所述的基體電極是玻碳電極、氧化銦錫電極、鉑電極中的其中一種；最優(yōu)選的，所述的基體電極是氧化銦錫電極。優(yōu)選的，所述的樹枝狀金屬為貴金屬的其中一種；進一步優(yōu)選的，所述的樹枝狀金屬為金、銀中的其中一種；最優(yōu)選的，所述的樹枝狀金屬為金。優(yōu)選的，所述的負載抗體標(biāo)記物的介孔材料吸附有活性物質(zhì)。優(yōu)選的，所述的活性物質(zhì)為二茂鐵、亞甲基藍、苯醌、血紅素中的至少一種；進一步優(yōu)選的，所述的活性物質(zhì)為亞甲基藍、血紅素中的至少一種。優(yōu)選的，所述的介孔材料為改性的硅基介孔材料；進一步優(yōu)選的，所述的介孔材料為改性的二氧化硅介孔材本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種基于DNA功能化納米復(fù)合材料的電化學(xué)免疫傳感器，其特征在于：是在基體電極上負載樹枝狀金屬后，再加入負載抗體標(biāo)記物的介孔材料，接著引入DNA雜交鏈，最后加入活性物質(zhì)后形成的。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于DNA功能化納米復(fù)合材料的電化學(xué)免疫傳感器，其特征在于：是在基體電極上負載樹枝狀金屬后，再加入負載抗體標(biāo)記物的介孔材料，接著引入DNA雜交鏈，最后加入活性物質(zhì)后形成的。2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種基于DNA功能化納米復(fù)合材料的電化學(xué)免疫傳感器，其特征在于：所述的基體電極是碳電極、金屬電極中的其中一種。3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種基于DNA功能化納米復(fù)合材料的電化學(xué)免疫傳感器，其特征在于：所述的樹枝狀金屬為貴金屬的其中一種。4.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種基于DNA功能化納米復(fù)合材料的電化學(xué)免疫傳感器，其特征在于：所述的負載抗體標(biāo)記物的介孔材料吸附有活性物質(zhì)。5.根據(jù)權(quán)利要求1或4中所述的一種基于DNA功能化納米復(fù)合材料的電化學(xué)免疫傳感器，其特征在于：所述的活性物質(zhì)為二茂鐵、亞甲基藍、苯醌、血紅素中的至少一種。6.根據(jù)權(quán)利要求4中所述的一種基于DNA功能化納米復(fù)合材料的電化學(xué)免疫傳感器，...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉英菊，甘翠芬，何祖宇，魏婕，敖日其冷，
申請(專利權(quán))人：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：廣東;44
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