一種測定甘膽酸的試劑及制備方法技術

本發明專利技術涉及一種測定甘膽酸的試劑及制備方法。目的是提供的試劑應具有準確度高的特點；提供的試劑制備方法具有制作方便的特點。技術方案是：一種測定甘膽酸的試劑，包括以下成分：a、甘膽酸試劑1；b、甘膽酸試劑2；c、液體型甘膽酸參考校準品。一種測定甘膽酸試劑的制備方法，按照以下步驟進行：1）甘膽酸試劑1：按配方量混合；2）甘膽酸試劑2：（1）取懸浮液；（2）混合物反應；（3）得羧基膠乳微球懸浮液；（4）調整濃度；（5）取（3）中的懸浮液加入（4）中；（6）反應；（7）加入乙醇胺；（8）離心處理；3）液體型甘膽酸參考校準品：按配方量混合得混合液，按CG含量排列或在混合液中加入CG純品，得CG參考校準品。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種測定甘膽酸的試劑及試劑的制備方法，特別是采用乳膠增強免疫 比濁法測定血清或血漿中的甘膽酸的試劑及相應的制備方法，可廣泛應用在醫學及生物化 學

技術介紹
血清甘膽酸(Cholyglycine，CG)是膽酸與甘氨酸結合二次的結合型膽酸之一，在 肝細胞內，膽固醇經過及其復雜的酶促反應，轉變成初級膽汁酸。其中有膽酸(CA)和鵝去 氧膽酸(CD-CA)。膽酸的類固醇核上有三個羥基(C3、C7、C12)，側鏈末端的羥基以肽鍵與甘 氨酸結合，CG由肝細胞合成，經毛細膽管、膽管排入膽囊，隨同膽汁進入十二指腸，幫助食物 消化。95%膽酸在回腸末端重吸收，經門靜脈再回肝臟，由肝細胞攝取再利用。在血清中主 要以蛋白結合形式存在。正常情況下，外周血中膽酸含量甚微，正常成人無論空腹或餐后， 其血清CG濃度穩定在低水平。當肝細胞受損時，肝細胞攝取CG能力下降，致使血中CG含量 增高；膽汁郁滯時，肝臟排泄膽酸發生障礙，而返流血液循環的CG含量增高，也使血CG含量 增高。測定血清甘膽酸(CG)是評價肝細胞功能及其肝膽系物質循環功能的敏感指標之一。 另外孕婦在懷孕的中后期，由于嬰兒的增大，會壓迫肝臟，使肝臟排泄膽酸發生障礙而導致 甘膽酸偏高，另外由于妊娠期胎盤合成和分泌大量雌激素和孕激素以及代謝負荷增大，可 誘發肝膽系統的變化，使孕婦易患妊娠肝內膽汁淤積癥(ICP)，對胎兒產生嚴重的影響，隨 ICP患者血清CG增高使羊水污染率、早產率、胎兒宮內窘迫率及剖宮產率增高，嚴重者可導 致嬰兒的死亡，因此測定孕婦血清甘膽酸，對及早發現ICP和了解ICP的嚴重程度有著非常 重要的意義，甘膽酸的測定可作為篩查和隨訪ICP的指標。從而降低圍產兒病死率。目前檢測CG常用的實驗室方法有放射免疫學分析法(RIA)、化學發光免疫分析法 (CLIA)、酶聯免疫法(ELISA)，放射免疫學分析法(RIA)檢測耗時長(19 22h)，而且有放 射性元素的污染，標記物穩定性差，廢棄物難以處理而使其受到限制。化學發光免疫分析法 (CLIA)是利用化學發光物質經催化劑催化和氧化劑氧化，形成一個激發態的中間體，這種 激發態的中間體回到穩定基態時，發出光子，利用發光信號測量儀測量光子數，從而間接測 定CG的濃度。目前市場上有管式和板式兩種試劑盒，但此法存在吖啶酯、魯米諾、異魯米諾 直接標記抗體的發光效率低，標記物不穩定的缺點；而且這種直接標記法屬于瞬間發光型， 很難保證測試結果的穩定性和重復性，而且需要特殊的檢測儀器。不便于常規實驗室開展。 而利用生物素-親和素系統檢測CG的電化學發光免疫試劑盒，需要配套昂貴的全自動電化 學發光檢測儀，常規實驗室無法開展，而且給患者帶來不必要的費用，增加患者負擔。酶聯 免疫法(ELISA)自動化程度不高，且受人為因素影響較大，重復性差，整個反應測定時間也 很長(至少需要40分鐘)。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是克服上述
技術介紹
的不足，提供一種甘膽酸檢測試齊IJ;所提供的試劑應具有操作簡單、測定時間短、準確度高、重復性好的特點，并可適用于各種類型的全自動生化分析儀的甘膽酸測定；所提供的試劑制備方法應具有制作方便以及成本不高的特點。 本專利技術提供的技術方案是一種測定甘膽酸的試劑， 包括以下成分及含量a、甘膽酸試劑1:緩沖液 pH值5-10電解質表面活性劑防腐劑穩定劑反應促進劑其余是純化水，試劑I的PH為7. 2-8. O ；b、甘膽酸試劑2 :帶有抗人CG抗體的膠乳顆粒穩定劑防腐劑10-400mmoi/L 10-400rnmol/L 0.01-10g/L 2-3 mmol/L 4-5 mmol/L 0.01-50g/L0.0001-0.05rnl/ml 2-4mmol/L 2-4 rnmol/L6.0-8.5 50rnmo!/L緩沖液pf其余是純化水，所述帶有抗人CG抗體的膠乳顆粒，其中的羧基膠乳微球粒徑為20-500nm ； C、液體型甘膽酸參考校準品防腐劑穩定劑緩沖液pH 1Ι 2-4mmo!/L 160-180mnioi L 10-400mmol/L'rp.曰_>迫里CG純品其余為純化水；所述液體型甘膽酸參考校準品包括5份形成系列濃度的參考校準品；5份參考校準品中的 CG 含量由低到高分別為1. 25mg/ml、2. 5mg/ml、5. 0mg/ml、10. 0mg/ml、20. Omg/ml ； 或者，所述液體型甘膽酸參考校準品是單點高濃度的CG參考校準品。所述緩沖液是磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液、1，4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)緩沖液、4-(2-羥乙基)哌嗪-1-1乙烷磺酸(HEPES)緩沖液、三羥甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸緩沖液、3-嗎啉丙磺酸(MOPS)緩沖液、3-(N-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸(MOPSO)緩沖液、2-嗎啉乙磺酸(MES)緩沖液中的一種或兩種以上任意比例的混合。所述試劑I中緩沖液的濃度為20-200mmol/L，緩沖液的pH值為7. 0-8. O。所述反應促進劑是聚乙二醇或硫酸葡聚糖(DS-50 )。所述反應促進劑濃度為O. 01_50g/L。所述反應促進劑濃度優選O. 05_30g/L。所述電解質是陰離子電解質或陽離子電解質，濃度為50-200mmol/L。所述穩定劑是乙二胺四乙酸二鈉、牛血清白蛋白、氯化鈉中的一種或兩種以上任意比例的混合。所述電解質優選陽離子中的氯化鈉。所述表面活性劑是非離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑或兩性離子表面活性劑；所述表面活性劑濃度為O. 5-lg/L。所述非離子表面活性劑,是Theist、Tween、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚中的一種或兩種以上任意比例的混合。所述甘膽酸試劑2中帶有抗人CG抗體的膠乳顆粒的含量為O. 002-0. 01ml/ml。一種測定甘膽酸試劑的制備方法，按照以下步驟進行 I)甘膽酸試劑1:按配方量將各成分混合，然后調節pH值即成；2)甘膽酸試劑2:(I)取羧基膠乳微球用緩沖液稀釋成O. Olmg/ml的懸浮液；(2)按Iml的羧基膠乳微球懸浮液加20mg EDAC (乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺) 和40mg的NHS (N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽)的比例，立即混勻后在室溫將此混合物反應 15-30分鐘，不斷攪拌；(3)用緩沖液或純化水洗滌羧基膠乳微球，除去未反應的NHS和EDAC，并將膠乳微球在純化水中懸浮，得膠乳微球含量為O. Olmg/ml的羧基膠乳微球懸浮液；(4)將抗人甘膽酸抗體溶于緩沖溶液中，使抗人甘膽酸抗體的蛋白質濃度為 O. 25mg/ml ；(5)取步驟(3)中的羧基膠乳微球懸浮液Iml立即加入步驟(4)中抗人甘膽酸抗體Iml ;使混合液中羧基膠乳微球、抗人甘膽酸抗體和緩沖溶液的含量分別為O. 005mg/ml、O.125mg/ml、25mmol/L ；(6)將混合物在37°C反應3小時，不斷攪拌；(7)按Iml反應混合物2. 5μ I乙醇胺的比例加入乙醇胺，然后反應10_30分鐘，不斷攪拌；(8)離心處理除去未結合的蛋白質和乙醇胺，再用緩沖液稀釋，使混合液中帶有抗本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種測定甘膽酸的試劑，包括以下成分及含量：a、甘膽酸試劑1：其余是純化水，試劑1的pH為7.2?8.0；b、甘膽酸試劑2：其余是純化水，所述帶有抗人CG抗體的膠乳顆粒，其中的羧基膠乳微球粒徑為20?500nm；c、液體型甘膽酸參考校準品：其余為純化水；所述液體型甘膽酸參考校準品包括5份形成系列濃度的參考校準品；5份參考校準品中的CG含量由低到高分別為1.25mg/ml、2.5mg/ml、5.0mg/ml、10.0mg/ml、20.0mg/ml；或者，所述液體型甘膽酸參考校準品是單點高濃度的CG參考校準品。FDA00002572411000011.jpg,FDA00002572411000012.jpg,FDA00002572411000013.jpg

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳開華，其他發明人請求不公開姓名，
申請(專利權)人：元升生物科技上海有限公司，
類型：發明
國別省市：