本發明專利技術公布了日本沼蝦MnRXR基因、其擴增引物組及擴增方法。利用本發明專利技術提供的引物組從日本沼蝦肝胰腺組織中克隆到了MnRXR基因全長cDNA序列，該基因包括兩種可變剪切體MnRXR-L和MnRXR-S。本發明專利技術對日本沼蝦MnRXR基因功能尤其在蛻皮周期中的重要作用的研究奠定重要基礎。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及日本沼蝦MnRXR基因、其擴增弓丨物組及擴增方法。
技術介紹
維甲酸X受體(RXR,retinoid x receptor)是動物核受體(nuclear receptor)超家族最保守的成員之一，在脊椎動物和無脊椎動物中都有發現。RXR具有重要的生物學功能，在脊椎動物發育、代謝、細胞分化、凋亡等多個生物學過程都發揮重要作用，而在無脊椎動物中主要與脫皮激素受體(ecdysteroid receptor, ECR)作用形成異源二聚體,脫皮激素進入細胞內與之結合形成有功能的形式從而調控下游一系列蛻皮相關的基因的表達，最終觸發動物的蛻皮反應。RXR-ECR異源二聚體是甲殼類等蛻皮分子信號途徑必不可少的關鍵節點。 日本沼奸(Macrobrachium nipponense),俗名青奸，河奸，隸屬甲殼綱(Crustacean)、十足目(Decapoda)、長臂蟲下科(Palaemonidae)、沼蟲下屬(Macrobrachium),在中國各地都有分布,是我國重要的淡水養殖種類。與高等動物的連續生長不一樣，甲殼類動物的生長是跳躍式的，每蛻皮一次體重增長近一倍，蛻皮對甲殼類動物生長極為重要。探求蝦蟹蛻皮的分子機制，掌握其中的主要變化，對經濟蝦蟹類養殖獲得更高的產量具有重要的指導意義。目前，有幾種奸蟹類RXR基因已被克隆，包括-Marsupenaeus Japonicas^Fenneropenaeus chinensis^ Crangon crangon 等，而日本沼奸的 RXR 基因(這里命名為MnRXR')還未見報道。我們利用 RACE (rapid-amplification of cDNA ends)克隆技術克隆了日本沼蝦基因全長cDNA，并發現基因有兩種可變剪切體ifo/MTP-Z和ifo/MTP-&這些結果對了解日本沼蝦的蛻皮過程具有重要意義。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供日本沼蝦ifo/MTP基因、其擴增引物組及擴增方法。本專利技術所述的日本沼蝦基因，有兩種可變剪切體ifo/MTP-Z和ifo/MTP-S，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 2所示。本專利技術還提供了用于擴增日本沼蝦基因，包括兩種可變剪切體ifo/MTP-Z和ifo/MTP-S的引物組，M7TMTP-Z和共用一組擴增引物，其由如下引物組成 3'正向外引物3aMnRXR-Fl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示; 3'正向內引物3aMnRXR-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示; 5'反向外引物5aMnRXR-Rl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示; 5'反向外引物5aMnRXR-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。本專利技術還提供了一種擴增日本沼蝦基因，包括兩種可變剪切體ifo/MTP-Z和MnRXR-S的方法，包括如下步驟 步驟1:獲得日本沼蝦肝胰腺組織的總RNA ；步驟2 :從日本沼奸高通量測序數據庫(NCBI accession number SRA051767. 2)中篩選到基因片段，以此作為中間序列； 步驟3 :以步驟I所得總RNA為模板，以所述的引物組為引物，通過PCR擴增獲得日本沼蝦MnRXR基因的3'和5'端片段； 步驟4 :將所述基因中間序列、所述基因的3'和5'端片段拼接，即得。作為優選，步驟4所述擴增為套式兩輪PCR。對所得序列用NCBI網站進行blastx在線分析,與JfoTPiTP序列一致性(Sequencesproducing significant alignments )最高的前100個序列都是RXR或RXR在昆蟲中的同源蛋白超氣門蛋白(ultrspiracle, USP),其中前12個序列分別是七種不同的蟲下蟹類Crangon crangon、Uca pugila tor^Marsupenaeus japonicus、Fenneropenaeus chinensis.、Carcinus maenas.、Homarus americanus 取 Gecarcinus lateralis 白勺 RXR (包f舌不同白勺異型體或可變剪切體)，顯著性檢驗達到極大(e〈2xl0_18°)，可以確定所得序列為日本沼蝦RXR 基因。日本沼蝦基因推測的氨基酸序列具有典型的RXR核受體序列特征，包括N端DNA結合結構域(DNA binding domain, DBD)，主要有C2C2鋅指結構組成，C端配體結合結構域(ligand binding domain, LBD)。使用Clustalx1. 81將日本沼蝦MnRXR基因，包括兩種可變剪切體MnRXR-L和ifo/MTP-S所編碼的氨基酸序列與已公布的部分蝦蟹類RXR氨基酸序列進行比對，使用MEGA3.1軟件計算遺傳距離，結果顯和ifo/PZ/P-5·與一種褐奸(Oaflgo/ crangon)相似度最高(89. 1%)。通過對日本沼蝦MnRXR基因，包括兩種可變剪切體ifo/MTP-Z和MnRXR-S所編碼的氨基酸序列與其他物種RXR氨基酸序列利用Clustalx1. 81軟件進行序列比對分析和使用MEGA3.1軟件構建NJ系統發育樹(如圖1)，由系統發育樹可見，甲殼類RXR聚類在一個大的分支上。本專利技術以日本沼蝦肝胰腺組織為材料，利用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、嵌套聚合酶鏈式反應(nested-PCR)、3,端cDNA快速擴增(3' RACE)以及Y端cDNA快速擴增(5' RACE)的方法，對日本沼蝦MnRXR基因進行了研究，首次從日本沼蝦肝胰腺組織中克隆到了 MnRXR基因全長cDNA序列，包括兩種可變剪切體MnRXR-L和MnRXR-S，并對其所編碼的MnRXR的序列特征、同源性、進化地位及表達譜進行了分析，確定其為日本沼蝦RXR基因，這些結果對了解日本沼蝦的蛻皮過程具有重要意義。附圖說明圖1不同種類的動物RXR核受體的NJ系統進化樹； 圖2基因兩種可變剪切體ifo/MTP-Z和ifo/MTP-S的PCR驗證； 圖3 Μη/PXR基因在蛻皮周期受誘導表達，A :肝臟組織；B :肌肉組織； 圖4 基因兩種可變剪切體ifo/MTP-Z和在蛻皮周期過程中不同的表達情況，A :肝臟組織；B :肌肉組織。具體實施例方式下面結合實施例，進一步闡述本專利技術。本專利技術中日本沼蝦由無錫太湖漁民提供，試劑均可由市場購得，RNA純化等試劑購自美國Promega公司等，3' RACE和5' RACE試劑盒購自寶生物(大連)有限公司(Takara)。總RNA提取取IOOmg日本沼蝦肝胰腺組織在研缽中加液氮研磨，用Trizol法提取總RNA, Trizol試劑采用Invitrogen公司，提取方法根據使用說明書。日本沼蝦基因全長cDNA序列的克隆，包括兩個可變剪切體ifo/MTP-Z和MnRXR-S 以公開的甲殼動物Daphnia magna的RXR-1ike蛋白序列(GenBank accessionnumber :ABF74729.1)為比對模板,blastx 日本沼奸Roche 454測序數據庫(NCBI SequenceRead Archive accessi本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種日本沼蝦MnRXR基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1或SEQ?ID?NO.2所示。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：沈懷舜，周鑫，柏愛旭，任秀芳，
申請(專利權)人：中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，
類型：發明
國別省市：
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