本發明專利技術公開了一種FXYD6胞內區蛋白的表達和純化的方法，是采用核苷酸序列如SEQ?ID?No：2和SEQ?ID?No：3所示的引物對、利用PCR技術擴增FXYD6胞內區序列后，將擴增出的FXYD6胞內區序列插入到表達載體pGEX-6P-1中，構建重組載體pGEX-6P-1-FXYD6胞內區；再將重組載體轉化于宿主細胞中，并在宿主細胞中表達FXYD6胞內區重組蛋白；表達的重組蛋白進行鑒定后，通過親和層析柱進行純化，經過純化的蛋白再通過SDS-PAGE分析鑒定純度。本發明專利技術提供了FXYD6胞內區的純化蛋白，進一步可應用于制備FXYD6蛋白胞內區的單克隆抗體。為進一步研究FXYD6組織分布提供了有利工具。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物
，具體地，涉及FXYD6胞內區蛋白的表達與純化。
技術介紹
FXYD6基因定位于11號染色體長臂(llq23. 3)，FXYD6蛋白是FXYD家族新成員，全稱為包含FXYD結構域的轉運調節因子6 (FXYD domain-containing ion transportregulator 6)。它屬于單跨膜蛋白，其結構包含有細胞外固定的FXYD序列的單跨膜片段，為離子通道或離子通道調節器。FXYD6蛋白作為膜蛋白的功能區分布信號肽位于第l-18aa，胞外區位于19_38aa，跨膜區位于39_56aa，57_95aa是胞內區。FXYD6對于大鼠生后和成熟大腦的神經元的興奮性有很大的作用，然而在FXYD6與精神分裂癥的易感性的相關性方面的研究，美國、日本和中國的研究者得出的結論不一致。近期的研究顯示FXYD6蛋白通過調節Na+-K+-ATPase的活性，有助于產生和維持內淋巴的內耳蝸勢能和保證離子成分穩定，有助于內耳聽神經的平衡功能。有關FXYD6與腫瘤關系的研究鮮見報道，但FXYD家族突變或缺失很可能引起嚴重病理變化。國內周寧新教授領導的課題小組在對FXYD6與腫瘤的關系方面做了深入的研究，首先從不同分化膽管癌組織中分離得到的差異表達的L2cDNA片段，反向Northern雜交證實它在正常膽管組織低表達，在膽管癌組織中高表達，且在不同分化膽管癌組織中表達差異顯著，在低分化膽管癌中高表達，而高分化膽管癌中相對低表達。FXYD6 unigene拼接序列中包含L2cDNA，與定位于llq23. 3的FXYD基因家族中的新基因FXYD6高度同源(同源性98. 90%),并從組織cDNA文庫(肝、腦)獲得FXYD6基因全長序列。隨后又在基因和蛋白水平上對FXYD6在膽管癌組織表達進行了研究，發現人FXYD6基因在RNA水平上，在正常膽管、膽管癌中均存在表達，基因的表達量在正常膽管與膽管癌之間存在明顯差異，與膽管癌分化程度呈負相關。體外實驗證實，人FXYD6反義核酸可明顯抑制人膽管癌細胞細胞(QBC939)的體外增殖能力。出現上述研究結果的可能原因為FXYD6基因定位于11號染色體長臂(llq23. 3)，而11號染色體長臂是包括膽管癌、胰腺癌、肝癌在內的多種腫瘤細胞最常見的異常區。因此表達并純化FXYD6蛋白，進而制備FXYD6蛋白的單克隆抗體，可以為研究該分子在大腦組織中的具體功能和一些腫瘤發生及進展過程中的分子作用機制提供重要的工具。檢測該分子在不同組織中的分布情況，定量檢測FXYD6蛋白也有助于我們對一些腫瘤的早期診斷及鑒別診斷。
技術實現思路
本專利技術的主要目的是提供一種經過純化的FXYD6胞內區蛋白，為研究該分子在大腦組織中的具體功能和一些腫瘤發生及進展過程中的分子作用機制提供工具。為了實現上述目的，本專利技術采用以下技術方案一種FXYD6胞內區蛋白的表達和純化的方法，其步驟如下a.采用核苷酸序列如SEQ ID No 2和SEQ ID No 3所示的引物對，利用PCR技術擴增FXYD6胞內區基因；b.將擴增出的FXYD6胞內區基因插入到已用BamH I和Xho I雙酶切后的表達載體PGEX-6P-1中，構建重組載體pGEX-6P-l-FXYD6胞內區；C.將重組載體PGEX-6P-1-FXYD6胞內區轉化于宿主細胞中，并在宿主細胞中表達FXYD6胞內區蛋白；d.表達的FXYD6胞內區蛋白采用蛋白質免疫印記(Western Blot)進行鑒定，之后通過親和層析柱進行純化，經過純化的蛋白再通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析鑒定純度。如上所述的方法，其中，所述宿主細胞優選為原核細胞。如上所述的方法，其中，所述宿主細胞優選為大腸桿菌。·一對用于FXYD6胞內區蛋白的表達和純化的引物，其中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No :2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No :3所示。一種可在宿主細胞中表達FXYD6胞內區蛋白的重組載體，其是采用核苷酸序列如SEQ ID No :2和SEQ ID No :3所示的引物對、利用PCR技術擴增FXYD6胞內區基因后，將擴增出的FXYD6胞內區基因插入到已用BamH I和Xho I雙酶切后的表達載體pGEX_6P_l中，所得到的重組載體。一種可在宿主細胞中表達FXYD6胞內區蛋白的重組載體，其核苷酸序列如SEQ IDNo 4所示。一種含有如上所述的重組載體的宿主細胞。如上所述的宿主細胞，其優選為原核細胞。如上所述的宿主細胞，其優選為大腸桿菌。本專利技術的有益效果為本專利技術提供了 FXYD6胞內區的純化蛋白，進一步可應用于制備FXYD6蛋白胞內區的單克隆抗體。制備的FXYD6單克隆抗體可以應用于免疫組化、Western Blot、ELISA等實驗，這樣就為進一步研究FXYD6組織分布提供了有利工具，也可以用FXYD6單克隆抗體通過免疫印跡和免疫沉淀來研究FXYD6與其它蛋白相互作用情況。附圖說明圖I為原核質粒pGEX-6P-l的表達載體圖譜。圖2為重組質粒pGEX-6P-l-FXYD6胞內區的PCR鑒定結果。圖3為FXYD6胞內區重組蛋白表達的SDS-PAGE分析結果。圖4為FXYD6胞內區重組蛋白表達的Western Blot檢測結果。圖5為純化后的FXYD6胞內區重組蛋白的SDS-PAGE分析結果。具體實施例方式一、實驗材料UTaq DNA聚合酶、限制性內切酶BamH I、Xho I和T4 DNA連接酶(TaKaRa公司)2、FXYD6全長cDNA序列(武漢三鷹生物技術有限公司)3、克隆質粒載體 pMDl8_T Simple Simple (TaKaRa 公司)4、表達質粒載體 pGEX_6P_l (TaKaRa 公司)5、質粒提取試劑盒(TaKaRa公司)6、克隆宿主大腸桿菌Trans 10、表達宿主大腸桿菌BL21 (TaKaRa公司)7、鼠抗GST標簽單克隆抗體(HaiGene公司)8、GST融合蛋白親合層析柱(Sigma公司)9、HRP (辣根過氧化物酶)標記羊抗小鼠IgG(北京經緯博恒生物科技開發有限責任公司)KKWestern Blot Kit高靈敏度化學發光檢測試劑盒(北京康為世紀生物有限公司)二、實驗方法I、引物設計與合成FXYD6蛋白的開放閱讀框cDNA序列如序列表SEQ ID No : I所示，其中，169-288位核苷酸序列為胞內區序列。參考如圖I所示的原核質粒PGEX-6P-1的圖譜，為方便克隆且保證目的基因片段以一個方向插入質粒中，克隆FXYD6胞內區序列，并在克隆的同時，在其上下游分別添加BamH I和Xho I酶切位點，此位點為質粒pGEX_6P_l所帶有。為實現上述目的，設計以下一對引物上游引物Pl(SEQ ID No. 2) :5' -ggatccctaa gtcgcaggtg caag-31 ,其中 ggatcc為BamH I酶切位點；下游引物P2 (SEQ ID No. 3) 5 1 -ctcgagtcag ttctctgctt tctgg-3 1，其中ctcgag為Xho I酶切位點。2、目的基因的擴增(I)PCR反應體系如表I所示。表IPCR 反應體系(50 μ L)序號成分各成分用量本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種FXYD6胞內區蛋白的表達和純化的方法，其特征在于，步驟如下：a.采用核苷酸序列如SEQ?ID?No：2和SEQ?ID?No：3所示的引物對，利用PCR技術擴增FXYD6胞內區基因；b.將擴增出的FXYD6胞內區基因插入到已用BamH?I和Xho?I雙酶切后的表達載體pGEX?6P?1中，構建重組載體pGEX?6P?1?FXYD6胞內區；c.將重組載體pGEX?6P?1?FXYD6胞內區轉化于宿主細胞中，并在宿主細胞中表達FXYD6胞內區蛋白；d.表達的FXYD6胞內區蛋白采用蛋白質免疫印記進行鑒定，之后通過親和層析柱進行純化，經過純化的蛋白再通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析鑒定純度。
【技術特征摘要】
1.一種FXYD6胞內區蛋白的表達和純化的方法，其特征在于，步驟如下 a.采用核苷酸序列如SEQID No :2和SEQ ID No :3所示的引物對，利用PCR技術擴增FXYD6胞內區基因； b.將擴增出的FXYD6胞內區基因插入到已用BamHI和Xho I雙酶切后的表達載體PGEX-6P-1中，構建重組載體pGEX-6P-l-FXYD6胞內區； c.將重組載體PGEX-6P-1-FXYD6胞內區轉化于宿主細胞中，并在宿主細胞中表達FXYD6胞內區蛋白； d.表達的FXYD6胞內區蛋白采用蛋白質免疫印記進行鑒定，之后通過親和層析柱進行純化，經過純化的蛋白再通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析鑒定純度。2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞為原核細胞。3.如權利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞為大腸桿菌。4.一對用于FXYD...
【專利技術屬性】
技術研發人員：周寧新，
申請(專利權)人：周寧新，
類型：發明
國別省市：
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