本發明專利技術公開了一種肺囊康定B0合成相關蛋白glpks3及其編碼基因。本發明專利技術提供的蛋白質，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；（b）將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與肺囊康定B0合成相關的由序列1衍生的蛋白質。抑制Glarea?lozoyensis中所述蛋白的編碼基因的表達，使肺囊康定B0的產量提高了4倍。本發明專利技術為深入研究肺囊康定生物合成的代謝調控提供了理論依據，可用于通過基因敲除提高肺囊康定B0的產量，為卡泊芬凈的高產提供保證。
【技術實現步驟摘要】
肺囊康定Bo合成相關蛋白glpks3及其編碼基因
本專利技術涉及一種肺囊康定Btl合成相關蛋白glpks3及其編碼基因。
技術介紹
卡泊芬凈(Caspofungin)是第一個獲得美國FDA批準上市的棘白菌素(Echinocandin)類抗真菌藥物,能夠特異性的抑制真菌細胞壁β- (I, 3)-D-葡聚糖的合成，使真菌溶解，具有良好的抗真菌活性，并且對患者不會產生類似兩性霉素B等藥物的細胞毒性，因此也被譽為抗真菌藥物中的青霉素。卡泊芬凈在臨床上用于治療對其它治療無效或不能耐受的侵襲性曲霉病和念珠菌菌血癥及繼發的念珠菌性腹腔膿腫和腹膜炎患者。2009年其全球銷售額為6.17億美元，在中國整個抗真菌藥物醫院市場中所占份額為12.45%，位居第四。目前，尚無國產的卡泊芬凈產品，國內使用均需進口，單支售價高達千元。然而，默克公司對于卡泊芬凈的專利權將于2013年到期，屆時卡泊芬凈國產化勢在必行，這將帶來巨大的經濟價值。卡泊芬凈的前體物是由Glarea 1zoyensis產生的肺囊康定(pneumocandin) B。，因此Glarea 1zoyensis中肺囊康定B。合成至關重要。Glarea 1zoyensis屬于子囊菌門(Ascomycota)錘舌菌綱(Leotiomycetes)柔膜菌目(Helotiales),為無性型絲狀真菌。1991年，Adefarati等通過NMR等技術分析了肺囊康定B。的結構,發現該化合物是由蘇氨酸、trans-4-羥基脯氨酸、3，4-二羥基高酪氨酸、3-羥基谷氨酰胺、trans-3-羥基脯氨酸和4，5- 二羥基鳥氨 酸組成的環六肽主鏈和一條10，12- 二甲基-豆蘧酸酯的聚酮側鏈構成的。肺囊康定Btl的結構(R=H)如下: OH h0W0h \Vo OH0 Jh HOH式(I)。 O==V-N N、， P HO代謝調控和分子改造是大幅度提高代謝產物的方法，尋找與肺囊康定Btl合成相關的基因，通過分子遺傳學操作有效地提高肺囊康定Btl的產量是急待解決的關鍵問題。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供肺囊康定Btl合成相關蛋白glpks3及其編碼基因。本專利技術提供了一種生產肺囊康定Btl的方法，包括如下步驟:培養工程菌，得到肺囊康定Btl ;所述工程菌是將抑制glpks3基因表達的產品導入Glarea 1zoyensis得到的重組菌；所述glpks3基因為編碼glpks3蛋白的DNA分子；所述glpks3蛋白為如下(a)或(b):(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列I所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與肺囊康定Btl合成相關的由序列I衍生的蛋白質。所述glpks3基因具體可為如下(I)或(2)或(3)或(4)所述的DNA分子:(I)編碼區如序列表中序列3所示的DNA分子；(2)序列表中序列2所示的DNA分子；(3)在嚴格條件下與(I)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼與肺囊康定Btl合成相關的蛋白的DNA分子；(4)與(I)或(2)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼與肺囊康定B。合成相關的蛋白的DNA分子。所述嚴格條件可為如下:50°C，在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4和ImMEDTA的混合溶液中雜交，在50°C，2XSSC，0.1%SDS中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS,0.5MNaPO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，I X SSC, 0.1%SDS中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS,0.5M NaPO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，0.5XSSC,0.1%SDS 中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS、0.5M NaPO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，0.1 X SSC，0.1%SDS中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS,0.5M NaPO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在65。。，0.1XSSC,0.1%SDS中漂洗；也可為:在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65° C下雜交，然后用 2 X SSC, 0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。所述“抑制glpks3基因表達的產品”為可以通過同源重組使所述glpks3基因失活的質粒。所述同源重組所借助的一對同源臂可為序列表的序列2自5’末端第473至3522位核苷酸所示的同源臂和序列表的序列2自5’末端第4332至8512位核苷酸所示的同源臂。所述“抑制glpks3基因表達的產品”具體可為如下重組質粒:骨架載體為載體pAgl-H3，在所述骨架載體的不同多克隆位點分別插入序列表的序列2自5’末端第473至3522位核苷酸所示的DNA片段甲和序列表的序列2自5’末端第4332至8512位核苷酸所示的DNA片段乙得到的重組質粒。本專利技術還保護抑制所述glpks3基因表達的產品在提高肺囊康定Btl產量中的應用。所述肺囊康定Bci產量具體指的是Glarea 1zoyensis中的肺囊康定Bci的產量。所述“抑制glpks3基因表達的產品”為可以通過同源重組使所述glpks3基因失活的質粒。所述同源重組所借助的一對同源臂可為序列表的序列2自5’末端第473至3522位核苷酸所示的同源臂和序列表的序列2自5’末端第4332至8512位核苷酸所示的同源臂。所述“抑制glpks3基因表達的產品”具體可為如下重組質粒:骨架載體為載體pAgl-H3，在所述骨架載體的不同多克隆位點分別插入序列表的序列2自5’末端第473至3522位核苷酸所示的DNA片段甲和序列表的序列2自5’末端第4332至8512位核苷酸所示的DNA片段乙得到的重組質粒。本專利技術還保護一種重組質粒，它的骨架載體為載體pAgl_H3，在所述骨架載體的不同多克隆位點分別插入序列表的序列2自5’末端第473至3522位核苷酸所示的DNA片段甲和序列表的序列2自5’末端第4332至8512位核苷酸所示的DNA片段乙。本專利技術還保護所述重組質粒在抑制所述glpks3基因表達中的應用。本專利技術還保護將所述重組質粒導入Glarea 1zoyensis得到的重組菌。本專利技術還保護所述重組菌在生產肺囊康定Btl中的應用。所述應用中，用重組菌在生產肺囊康定Btl的具體方法如下:將0.5cmX0.5cm的重組菌菌落接種至25mL LYCP-5產孢培養基，然后25°C、200rpm振蕩培養4天，得到的孢子液；將所述的孢子液以5%(體積比)的接種量轉接至FGY培養基，25°C、200rpm振蕩培養14天。本專利技術還保護glpks3蛋白，來自Glarea 1zoyensis,為如下(a)或(b):(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列I所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與肺囊康定Btl合成相關的由序列I衍生的蛋白質。所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。為了使(a)中的蛋白便于純化，可在由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種生產肺囊康定B0的方法，包括如下步驟：培養工程菌，得到肺囊康定B0；所述工程菌是將抑制glpks3基因表達的產品導入Glarea?lozoyensis得到的重組菌；所述glpks3基因為編碼glpks3蛋白的DNA分子；所述glpks3蛋白為如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；（b）將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與肺囊康定B0合成相關的由序列1衍生的蛋白質。
【技術特征摘要】
1.一種生產肺囊康定Btl的方法，包括如下步驟:培養工程菌，得到肺囊康定Btl ;所述工程菌是將抑制glpks3基因表達的產品導入Glarea 1zoyensis得到的重組菌；所述glpks3基因為編碼glpks3蛋白的DNA分子；所述glpks3蛋白為如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b)將序列表中序列I所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與肺囊康定Btl合成相關的由序列I衍生的蛋白質。2.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述glpks3基因是如下(I)或(2)或(3)或(4)所述的DNA分子: (1)編碼區如序列表中序列3所示的DNA分子； (2)序列表中序列2所示的DNA分子； (3)在嚴格條件下與(I)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼與肺囊康定Btl合成相關的蛋白的DNA分子； (4)與(I)或(2)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼與肺囊康定B。合成相關的蛋白的DNA分子。3.如權利要求2所述的方法，其特征在于:所述“抑制glpks3基因表達的產品”為可以通過同源重組使所述glpks3基因失活的質粒。4.一種重組質粒， 它的骨架載體為載體pAgl-H3，在所述骨架載體的不同多克隆位點分別插入序列表的序列2自5’末端第473至35...
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉杏忠，安志強，岳群，陳里，向梅春，
申請(專利權)人：中國科學院微生物研究所，
類型：發明
國別省市：北京;11
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