本發(fā)明專利技術(shù)公開了多角體基因前180bp片段及其應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明專利技術(shù)的多角體基因前180bp片段核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。該片段可以應(yīng)用于融合蛋白的表達(dá)。本發(fā)明專利技術(shù)還公開了一種表達(dá)載體，由出發(fā)載體的多克隆位點(diǎn)依次插入上述片段和蛋白酶酶切位點(diǎn)片段構(gòu)建而成。本發(fā)明專利技術(shù)的多角體基因前180bp序列比其全長序列具有更優(yōu)異的性質(zhì)，可以與其他目的基因連接表達(dá)融合蛋白，不但能夠?qū)崿F(xiàn)提高表達(dá)量的效果，還可以增加融合蛋白在中性pH值條件下的溶解性，使其適用于蛋白酶酶切功能的最佳pH值，大大方便了目的蛋白的獲取。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及基因工程
，具體涉及多角體基因前ISObp片段及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
家香(Bombyx mori)多角體蛋白(Polyhedrin, Polh)基因共有738個核苷酸,編碼由245個氨基酸組成的大小為29 kD的多肽，是多角體的主要結(jié)構(gòu)成份。多角體蛋白構(gòu)成的蛋白質(zhì)晶體對包埋在其中的病毒體具有保護(hù)作用，它使病毒體在自然環(huán)境中保持穩(wěn)定和侵染能力。多角體蛋白基因是一個超表達(dá)極晚期基因。在病毒感染的晚期，當(dāng)其它病毒基因和宿主基因關(guān)閉后，此基因能持續(xù)高水平表達(dá)，在受感染細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的多角體蛋 白的量可達(dá)細(xì)胞蛋白質(zhì)總量的25% 50%。近20年來，人們都致力于研究多角體蛋白基因的高效表達(dá)機(jī)制，并且利用它的這種特性使許多外源基因得到了高效表達(dá)，尤其是一些難以表達(dá)的蛋白例如膜蛋白。家蠶核型多角體病毒的多角體蛋白具有它獨(dú)特的性質(zhì)，在大腸桿菌中表達(dá)的多角體蛋白在中性PH值條件下以包涵體的形式存在，只有在堿性條件(pH值10. 8及以上)下可溶，并且這種多角體蛋白具有與天然多角體蛋白晶體相同的性質(zhì)。因此，可將目的蛋白基因與其融合表達(dá)，一方面能提高目的蛋白的表達(dá)量，另一方面，通過簡單的PH梯度洗脫和差速離心的方法就可以獲得較純的融合蛋白，再經(jīng)過特異性蛋白酶酶切消化，回收得到較純的目的蛋白。但是，目前采用多角體融合外源蛋白表達(dá)時，由于多角體只有在堿性條件下才可溶，而在用蛋白酶進(jìn)行酶切融合蛋白而獲得單獨(dú)的目的蛋白的過程中，蛋白酶反應(yīng)的最適合PH值一般是中性(pH值疒9)條件下，這樣就造成了無法簡單地在酶最適的條件下通過酶切獲得單純的目的蛋白，而堿性條件下進(jìn)行酶切時，蛋白酶就會喪失活性或者無法達(dá)到最大活性，所得到的目的蛋白的量也受到限制。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為了解決上述問題，本專利技術(shù)提供了家蠶多角體蛋白基因片段，該片段與目的基因融合表達(dá)后，除了能夠滿足大量表達(dá)的要求外，其溶解性質(zhì)也發(fā)生改變，在蛋白酶適宜的PH值范圍內(nèi)即可溶解，大大簡化了酶切及純化步驟。本專利技術(shù)的多角體蛋白基因前180bp片段，核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。上述多角體蛋白基因前180bp片段在蛋白融合表達(dá)中的應(yīng)用。—種表達(dá)載體，是由出發(fā)載體的多克隆位點(diǎn)依次插入所述多角體蛋白基因前ISObp片段和蛋白酶酶切位點(diǎn)片段構(gòu)建而成。融合蛋白表達(dá)后用相應(yīng)的蛋白酶進(jìn)行酶切，獲得目的蛋白。優(yōu)選地，所述出發(fā)載體為pET系列載體、pcDNA3系列載體、pFastBac 系列載體、PKK系列載體或pBAD系列載體。其中pET系列載體的pET_28a為最佳。優(yōu)選地，所述的蛋白酶酶切位點(diǎn)片段為凝血酶酶切位點(diǎn)片段。所述凝血酶酶切位點(diǎn)片段核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。一種融合蛋白表達(dá)載體，是在出發(fā)載體的多克隆位點(diǎn)依次插入上述多角體蛋白基因前ISObp片段、蛋白酶酶切位點(diǎn)片段和目的基因片段構(gòu)建而成。優(yōu)選地，所述目的基因?yàn)镋GFP (增強(qiáng)型綠色熒光蛋白，Enhanced GreenFluorescent Protein)基因、LZM (溶菌酶，lysozyme)基因或MMgT (家蠶膜鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，membrane magnesium transporter protein) _因等。一種基因工程菌，包括上述融合蛋白表達(dá)載體。優(yōu)選地，該基因工程菌為大腸桿菌。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)具有以下有益效果 本專利技術(shù)在多角體基因polh的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)其部分序列比其全長序列具有更優(yōu)異的性質(zhì)，可以與其他目的基因共同表達(dá)融合蛋白，不但能夠?qū)崿F(xiàn)提高表達(dá)量的效果，還可以增加 融合蛋白在中性PH值條件下的溶解性，使其適用于蛋白酶酶切功能的最佳pH值，大大方便了目的蛋白的獲取。附圖說明圖I 是 pET-28a-polhl80_EGFP 質(zhì)粒圖譜。圖2是多角體基因前180pb片段的PCR產(chǎn)物電泳圖；其中，M:核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 目的基因PCR產(chǎn)物。圖3 是 EGFP 的 PCR 擴(kuò)增圖，M marker ； I EGFP 擴(kuò)增產(chǎn)物。圖4是重組表達(dá)載體鑒定圖，其中，M:核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 :EGFP基因PCR產(chǎn)物；2 :重組表達(dá)載體pET-28a-polhl80-EGFP經(jīng)AcoR I和通o I酶切后產(chǎn)物條帶。圖5是pET-28a-polhl80_EGFP蛋白表達(dá)結(jié)果，M :蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；I :pET-28a-polhl80-EGFP未誘導(dǎo)；2: pET-28a-polhl80_EGFP誘導(dǎo)；3 :pET_28a-poIh-EGFP誘導(dǎo)；4 pET-28a-EGFP 誘導(dǎo)。圖6是poIh 180-EGFP融合蛋白溶解性分析圖；其中，I、3、5、7、9、11、13是溶液pH為 8. 0,8. 4,9. 2,9. 6,10. 0,10. 4,10. 8 時的上清；2、4、6、8、10、12、14 是溶液 pH 為 8. 0,8. 4、9. 2,9. 6、10. O、10. 4、10. 8 時的沉淀。圖7是polhl80_EGFP蛋白溶液使用Gly回調(diào)pH值的電泳圖；其中，M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；5 polhl80-EGFP 上清(pH10. 8) ；6 :polhl80_EGFP 上清(pH9. 0) ；7 :polhl80_EGFP上清(pH8.0) ;8 :polhl80-EGFP 沉淀(pH8. 0) ;9 :polh_EGFP 上清(pH10. 8) ；10 poIh-EGFP 沉淀(pH10. 8)。圖8是polhl80_EGFP融合蛋白經(jīng)過凝血酶酶切后的電泳結(jié)果圖，其中M :蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 pH7. 6時的上清原樣；2 pH7. 6時凝血酶酶切后的樣品。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本專利技術(shù)作進(jìn)一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好地理解本專利技術(shù)并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對本專利技術(shù)的限定。以下實(shí)施例中使用的生物材料如家蠶核型多角體病毒、載體pET_28a、質(zhì)粒PGEX-4T-1-EGFP和E. coli TGl均購自特菲(天津)生物醫(yī)藥科技有限公司。實(shí)施例I :構(gòu)建表達(dá)載體pET28a-/ o7A180(I )/7o7A基因序列已知，可以使用任何含有該基因片段的質(zhì)粒或例如病毒等其他生物材料作為模版，本實(shí)施例以家蠶核型多角體病毒(BmNPV)基因組為模板擴(kuò)增多角體基因前ISObp的片段。引物設(shè)計(jì)如下: 上游引物 F :5’-CGCGGATCCATGCCGAATTAITCATACAC-3’ (SEQ ID NO: 3，方框內(nèi)為 I酶切位點(diǎn))； 下游引物R : 5’_ GGCGAATTCCTCGTTCCTCGTGGTTCTAAAGG GATCTTCGGCAA-3’ (SEQ ID NO:4，方框內(nèi)為 I酶切位點(diǎn)，下劃線部分為凝血酶酶切位點(diǎn))。(2)多角體蛋白基因前180bp片段擴(kuò)增 以病毒基因組為模板，步驟(I)的F和R序列為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系在IOOu L的離心管中，加入下列組分10 .■+: Taq Buffer I5 uL2.5mM dKTPsSuLTaq DKA p eras e1.5 uLFI uLRI uL模板I吣無菌取蒸水—總體枳50成 各組分混勻后，放入PCR儀中，反應(yīng)參數(shù)設(shè)計(jì)為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，55°本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
多角體蛋白基因前180bp片段，其特征在于，核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張耀洲，耿文杰，畢臻樂，舒特俊，陳劍清，
申請(專利權(quán))人：天津耀宇生物技術(shù)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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