本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種麥芽糊精底物特異性提高的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶及其制備方法，屬于遺傳工程和酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明專利技術(shù)通過(guò)對(duì)P.macerans?strain?JFB05-01(CCTCC?NO:M208063)的CGTase的195位的酪氨酸（Tyr）替換為絲氨酸（Ser）,260位的酪氨酸（Tyr）替換為精氨酸（Arg）,265位的谷氨酰胺（Gln）替換為賴氨酸（Lys），使AA-2G產(chǎn)量分別提高了23%，44%和40%。對(duì)以上突變株組合突變，獲得雙突變體Y195S/Y260R,Y195S/Q265K和Y260R/Q265K以及三點(diǎn)突變體Y195S/Y260R/Q265K。它們利用麥芽糊精為糖基供體生產(chǎn)AA-2G產(chǎn)量分別提高了57%，49%，55%和59%。這些突變株比野生型CGTase更利于利用麥芽糊精為糖基供體生產(chǎn)AA-2G。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶及制備方法，特別是一種麥芽糊精底物特異性提聞的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶及其制備方法。
技術(shù)介紹
L-抗壞血酸(L-AA，維生素C)是水溶性維生素，參與很多體內(nèi)的生理活動(dòng)，在保持和促進(jìn)人體健康中起到重要的作用，是人體無(wú)法自身合成的必需的營(yíng)養(yǎng)元素。但L-AA極不穩(wěn)定，在空氣中易被氧化為脫氫抗壞血酸，破壞分子中的共軛體系，發(fā)生不可逆裂解反應(yīng)，特別是在空氣、光線、熱和金屬離子的存在下，反應(yīng)更迅速，使L-AA的生理活性減弱甚至消失，這使得它在應(yīng)用上受到很大的限制。因此，如何增強(qiáng)L-AA的穩(wěn)定性是目前國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界所關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題。2-0- a -D-吡喃型葡萄糖基_L_抗壞血酸(AA-2G)是L-AA的糖基衍生物，是將一個(gè)糖基以α -1, 4-糖苷鍵連接于L-AA的C2位上。由于L-AA的C2位上有糖基掩蔽，不易發(fā)生氧化反應(yīng)，所以在水溶液中特別穩(wěn)定，并且AA-2G沒(méi)有直接還原性，有效地保護(hù)了 L-AA的生物活性。所以AA-2G是迄今發(fā)現(xiàn)的穩(wěn)定性和性能最佳的L-AA替代品。目前，AA-2G主要通過(guò)糖基轉(zhuǎn)移酶生物催化生成，其中環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)是最常用的催化酶。通常以α _環(huán)糊精或β _環(huán)糊精為糖基供體，將葡萄糖基催化轉(zhuǎn)移到受體L-AA上。然而，若以α-環(huán)糊精為糖基供體，成本太高；若以β-環(huán)糊精為糖基供體，由于它的溶解度較低，酶促反應(yīng)效率受到較大限制。因此，選擇一種既便宜又易溶的糖基供體(如麥芽糊精)將會(huì)大大減少AA-2G的生產(chǎn)成本，提高其利潤(rùn)。但是，由于目前環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)對(duì)麥芽糊精的底物特異性(轉(zhuǎn)化率)較低，因此，通過(guò)分子改造CGTase技術(shù)提高其對(duì)麥芽糊精的底物特異性，將推動(dòng)與L-AA糖基衍生物相關(guān)行業(yè)的快速發(fā)展。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種麥芽糊精底物特異性提高的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，以Genbank AF047363.1所示的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶為出發(fā)序列，第195位的酪氨酸突變成絲氨酸Y195S，第260位的酪氨酸突變成精氨酸Y260R，第265位的谷氨酰胺突變成精氨酸賴氨酸Q265K或其組合。所述環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶來(lái)源于軟化類芽孢桿菌(Peanibacillus macerans)。所述環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的獲得方法為以Genbank AF047363.1公布的基因?yàn)槌霭l(fā)基因，將第195位的酪氨酸突變成絲氨酸Y195S，第260位的酪氨酸突變成精氨酸Y260R，第265位的谷氨酰胺突變成精氨酸賴氨酸Q265K或?qū)⑵浣M合進(jìn)行雙突變或三突變。產(chǎn)所述環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的基因工程菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也為本專利技術(shù)要求保護(hù)的范圍。本專利技術(shù)要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因工程菌的構(gòu)建方法，具體步驟如下I)采用化學(xué)全合成或PCR方法克隆編碼所述環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因；2)將步驟I)獲得的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因連接到大腸桿菌表達(dá)載體，得到重組表達(dá)載體；3)將步驟2)獲得的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21得到基因工程菌。本專利技術(shù)要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種應(yīng)用所述基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，以產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的基因工程菌為生產(chǎn)菌株，活化后按4%接種量將種子發(fā)酵液接到含100 μ g/mL氨芐青霉素的TB液體培養(yǎng)基；大腸桿菌在30°C搖床培養(yǎng)至0D_=0. 6，加入O. OlmM終濃度的IPTG誘導(dǎo)胞外表達(dá)，并在25°C搖床繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵90h后，將發(fā)酵液于4°C、IOOOOrpm離心20min除菌體，收集富含環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的上清液。軟化類芽孢桿菌(Peanibacillusmacerans) JFB05-01 (CCTCC NO :M208063)，已在中國(guó)專利CN101294149公開，公開日2008年10月29日。來(lái)源于軟化類芽孢桿菌(Peanibacillus macerans) JFB05-01的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(簡(jiǎn)稱CGTase)的三種突變體酶Y195S，Y260R及Q265K，它們相比于野生型CGTase利用麥芽糊精為糖基供體生產(chǎn)AA-2G時(shí)，產(chǎn)量分別提高23%，44%和40%。Peanibacillus macerans JFB05_01CGTase 的三種雙突變體酶 Y195S/Y260R, Y195S/Q265K和Y260R/Q265K，相比于野生型CGTase利用麥芽糊精為糖基供體生產(chǎn)AA-2G產(chǎn)量分別提高了 57%，49%和55%。 Peanibacillus macerans JFB05_01CGTase 的一種三點(diǎn)突變體酶 Y195S/Y260R/Q265K，其特征是將雙突變體酶Y195S/Y260R基因中第265位的谷氨酰胺Gln突變成了精氨酸賴氨酸Lys，命名為Y195S/Y260R/Q265K。相比于野生型CGTase利用麥芽糊精為糖基供體生產(chǎn)AA-2G產(chǎn)量提高了 59%。本專利技術(shù)的有益效果本專利技術(shù)構(gòu)建了 7個(gè)有意義的突變體，均實(shí)現(xiàn)了環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)麥芽糊精的底物特異性的提高，以此為糖基供體所產(chǎn)AA-2G產(chǎn)量均高于野生型CGTase，更利于AA-2G工業(yè)化生產(chǎn)。附圖說(shuō)明圖1不同反應(yīng)時(shí)間下野生型CGTase和突變型酶生成AA-2G的產(chǎn)量。■:野生型 CGTase ；· Y260R ；▲ Q265K ；^:Y195S ;〇Y260R/Q265K ；Δ Y260R/Y195S ； :Q265K/Y195S; O :Y260R/Q265K/Y195S。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:底物特異性提高的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶本專利技術(shù)的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶是在GenBankAF047363.1公布的基因序列基礎(chǔ)上，對(duì)其3個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行氨基酸進(jìn)行單突變或組合突變獲得，具體獲得了 7種突變體，分別為Y260R ；Q265K ；Y195S；Y260R/Q265K ；Y260R/Y195S ；Q265K/Y195S ;Y260R/Q265K/Y195S。可以通過(guò)化學(xué)全合成或定點(diǎn)突變的方式將其成熟區(qū)的3個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行氨基酸的取代。實(shí)施例2 :底物特異性提高的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法本例以PCR方法為例進(jìn)行說(shuō)明，但被專利技術(shù)的保護(hù)并不限于僅通過(guò)PCR方法獲得突變的方法。突變體酶 Y195S，Y260R, Q265K, Y195S/Y260R, Y195S/Q265K, Y260R/Q265K 和Y195S/Y260R/Q265K的制備方法如下I)定點(diǎn)突變單突變體酶Y195S，Y260R及Q265K的定點(diǎn)突變，利用快速突變?cè)噭┖蠱utanBEST kit,以表達(dá)載體 cgt/pET_20b (+)1 (1. Li, Ζ·，B. Li, Z. Gu, G. Du, J. ffu, andJ. Chen.2010.Extracellular expression and biochemical characterization ofalpha-cyclodextrin glycosyltransferasefrom Paenibacillus macerans. CarbohydrRes345:886-892.)為模板，引入Y195S密碼子的頂點(diǎn)突變引物為正向引物5’-TACAAGAA本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種麥芽糊精底物特異性提高的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，以GenbankAF047363.1所示的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶為出發(fā)序列，其特征在于第195位的酪氨酸突變成絲氨酸Y195S，第260位的酪氨酸突變成精氨酸Y260R，第265位的谷氨酰胺突變成精氨酸賴氨酸Q265K或其組合。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳堅(jiān)，堵國(guó)成，劉龍，李江華，韓瑞枝，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：江南大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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