本發明專利技術提供了一類細胞色素P450?3A4酶的特異性探針底物及其在CYP3A4酶活測定中的應用，其中酶活測定的具體操作流程如下：選擇任一蟾蜍甾烯類系列化合物中的單體作為高特異性探針底物，并借助CYP體外孵育體系開展特異性底物的CYP催化反應，通過定量檢測單位時間內產物生成量或底物消除量來測定各生物樣品及細胞中CYP3A4酶的活性。本發明專利技術可用于不同種屬、不同個體來源生物樣本中CYP3A4酶活的定量評估，以及不同來源的動物組織細胞培養液及細胞制備物中CYP3A4酶活的定量測定。
【技術實現步驟摘要】
—類細胞色素P450 3A4酶的特異性探針底物及其應用
本專利技術屬醫藥
，具體涉及一類蟾蜍留烯類化合物,如華蟾毒精、去乙酰華蟾毒精、酯蟾毒配基和蟾毒靈三個化合物及其結構類似物，其可作為細胞色素P450 3A4酶的特異性探針底物，用于不同來源生物樣本中細胞色素P450 3A4酶活的定量測定，以期實現對重要藥物代謝酶CYP 3A4處置藥物能力的評估。
技術介紹
細胞色素P450酶(Cytochrome P450, CYP)超家族包含了機體內最重要的藥物代謝酶，參與約80%以上上市藥物的代謝，其中經細胞色素P4503A亞家族代謝的藥物約占50%。人體中表達了四種細胞色素P4503A亞型，分別為細胞色素P4503A4、P4503A5、 P4503A7以及P4503A43。細胞色素P4503A4占總細胞色素P450酶含量的30 60%(Annu Rev Pharmacol Toxicol 1999，39:1 - 17)，在肝、腸、腎、脾、心臟各器官中有非常廣泛的分布，相比于人群中表達量低、表達頻率低的細胞色素P4503A5, —直被認為是成年個體表達的最主要的細胞色素P4503A單酶。一般來講，CYP3A亞家族中的各種亞型的酶都具有相似的底物具體性，也就是說，某一底物若被CYP3A4催化代謝，那么這一底物就極可能同時被CYP3A5及其它CYP3A家族的酶代謝。目前，已經發現的或已在體外、體內研究中廣泛應用的CYP3A亞家族探針底物,如咪達唑侖(midazolam)、尼非地平(nifedipine)、睪酮 (testosterone)、雌二醇(estradiol)等，都同時是CYP3A4和CYP3A5的特異性底物。相對應的，利用這些探針底物對細胞色素P450酶進行的評估結果反映的就是細胞色素P4503A 亞家族各單酶的催化能力的總和。然而，近期的研究發現，細胞色素P4503A5在某些個體中顯現的催化能力甚至與細胞色素P4503A4的催化能力相當(Drug Metab Dispos 2002, 30:883-91 )，此時利用目前已有的探針則會混淆細胞色素P4503A4和3A5的催化能力，從而無法清晰地分析細胞色素P4503A4對某藥物的代謝清除能力。此外，在鼠(細胞色素P4503A1、細胞色素P4503A2)、狗(細胞色素P4503A12、細胞色素P4503A26)，兔( 細胞色素P4503A6)，豬(細胞色素P4503A29)，猴(細胞色素P4503A64) 等哺乳動物體內，也高表達細胞色素P4503A4的同功酶，這些酶之間的底物有非常廣泛的重疊性。利用細胞色素P4503A4的高特異性探針也可在體外活性測定方面實現對不同種屬中細胞色素P4503A4的同功酶的評價與考察。目前，細胞色素P4503A4酶活性的體外評價體系主要包括重組單酶、哺乳動物的亞細胞組分、新鮮提取的肝細胞、原代培養肝細胞、肝切片、肝灌流等(Toxicology in Vitro 2006，135 - 153)，其中已經商品化的重組細胞色素P4503A4單酶主要來自于細菌、 昆蟲細胞、哺乳動物細胞以及酵母菌建立的克隆表達體系，而亞細胞組分主要包括微粒體、 細胞胞漿及S9成分。采用這些標準化的評價體系，結合相應的輔因子(如=NADPH等)和孵育條件，可通過檢測探針底物的代謝清除或產物生成速率，對上述各種體系中表達的細胞色素P4503A4酶活性進行表征。余琢(CN101308119)等人還利用肝微量穿刺法構建了新型微量肝組織體外孵育體系，并采用咪達唑侖作為探針底物，通過測定咪達唑侖與其代謝產物I 一羥基咪達唑侖含量的比值，來作為細胞色素P4503A體外活性評價指標。綜上所述，評估細胞色素P4503A4代謝酶活性，關鍵在于選擇高特異性的探針藥物。
技術實現思路
本專利技術涉及一類蟾蜍留烯類化合物以及其在檢測細胞色素P4503A4酶活性中的用途及其檢測方法，蟾蜍留烯類化合物(bufadienolides)是一類留體類成分，該系列化合物具有圖1所示的基本結構，它可作為細胞色素P450 3A4酶的高特異性探針底物，用于定量測定不同來源生物樣本中CYP3A4酶活。與目前已報道的細胞色素P4503A探針/標準底物不同，蟾蜍留烯類系列化合物中的單體具有高特異性表征細胞色素P4503A4酶活性的能力，其并不被CYP3A5催化。因此能夠高特異性的評價機體或組織中CYP3A4酶對藥物的處置能力，對體外藥物代謝研究具有重要意義。本專利技術具體提供了一類細胞色素P450 3A4酶的特異性探針底物，其特征在于所述細胞色素P450 3A4酶的特異性探針底物為一類具有圖1所示結構的蟾蜍留烯類系列化合物中的單體，其中R1為一H、一OH或一OAc基團。其中蟾蜍甾烯類系列化合物中的單體優選華蟾毒精、去乙酰華蟾毒精、酯蟾毒配基或蟾毒靈。 本專利技術還提供了所述細胞色素P450 3A4酶特異性探針底物的應用，，其特征在于用蟾蜍留烯類系列化合物單體中的一種作為特異性探針底物，通過定量定時測定相應代謝產物的生成量或底物的減少量實現細胞色素P4503A4酶活性的檢測。采用重組細胞色素P450單酶，肝微粒體孵育體系進行考察，通過相關性分析， 特異性抑制實驗，重組單酶代謝反應，以及酶反應動力學幾方面的證據，證明華蟾毒精 (cinobufagin, CB),酯蟾毒配基(resibufagenin, RB)和蟾毒靈(bufalin, BF)三個化合物均可特異性的經細胞色素P450 3A4酶代謝(如圖2 4所示)，依次生成5 β -羥基華蟾毒精 (華蟾毒他靈)、Ia-羥化華蟾毒精，5 β -羥基酯蟾毒配基(海蟾蜍毒精)及5 β -羥基蟾毒靈 (遠華蟾毒精)，UFLC圖譜見圖5 7，代謝產物的結構見圖8。進一步采用各種哺乳動物的新鮮提取的肝細胞、原代培養肝細胞、肝切片、肝灌流等代謝評價體系進行考察，發現該代謝反應具有非常良好的特異性。作為高特異性的細胞色素Ρ450 3Α4的探針底物，華蟾毒精、去乙酰華蟾毒精、酯蟾毒配基、蟾毒靈等蟾蜍留烯類化合物中的任一單體均可以用來檢測細胞色素Ρ450 3Α4 酶活性，尤其適合用于對細菌、昆蟲細胞、哺乳動物細胞以及酵母菌克隆表達體系生產的細胞色素Ρ450 3Α4重組酶的酶活測定，以及多種哺乳動物組織器官來源的微粒體、S-9等制備物中CYP 3Α4的活性標定。本專利技術提供的所述細胞色素Ρ450 3Α4酶的特異性探針底物的應用，即采用所述探針底物檢測細胞色素Ρ450 3Α4酶活性，其測定方法及條件如下Α.選用蟾蜍留烯類系列化合物單體中的一種作為特異性探針底物；底物濃度為1-500μΜ ；B.在ρΗ=7.(Γ8. 5的緩沖液體系下加入NADPH或其生成體系的孵育體系，反應溫度為 2(T60°C之間；C.反應時間為10-120分鐘，在確保以上底物相應的羥化代謝產物達到定量限且底物轉化率低于10%時終止反應；D.測定單位時間內底物減少量或單羥化產物生成量作為細胞色素P450 3A4酶活性的評價指標。其中檢測底物減少量或其對應羥化產物生成量的定量檢測方法為紫外吸收光譜、 質譜、放射性同位素示蹤技術、熒光激發光譜、蒸發光散射或電化學光譜檢測。所有檢測器包括紫外吸收光譜檢測器、質譜、放射本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一類細胞色素P450?3A4酶的特異性探針底物，其特征在于：所述細胞色素P450?3A4酶的特異性探針底物為一類具有式（1）或式（2）結構的蟾蜍甾烯類系列化合物中的單體，其中R1為—H、—OH或—OAc基團。dest_path_image001.jpg
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：楊凌，葛廣波，寧靜，吳敬敬，杜遜甫，
申請(專利權)人：中國科學院大連化學物理研究所，
類型：發明
國別省市：
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