一種枇杷細胞懸浮培養(yǎng)液及懸浮培養(yǎng)方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種枇杷細胞懸浮培養(yǎng)液及懸浮培養(yǎng)方法。其中，培養(yǎng)液包括：MS基本培養(yǎng)基，2,4-D0.5-6.0mg/L；NAA0.5-6.0mg/L；IBA0.5-6.0mg/L；KT?0-4.0mg/L；BA0-4.0mg/L；蔗糖1-3.5%；pH4.0-6.5。培養(yǎng)方法為愈傷組織在該培養(yǎng)液中培養(yǎng)。本發(fā)明專利技術(shù)建立了枇杷細胞液體培養(yǎng)體系，采用本發(fā)明專利技術(shù)最佳方式培養(yǎng)，枇杷細胞培養(yǎng)物中熊果酸的得率為36.49mg/g·DW。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及生物
，具體地涉及枇杷細胞懸浮培養(yǎng)方法。
技術(shù)介紹
熊果酸是枇杷葉中最重要的次生代謝物質(zhì)，被中國醫(yī)藥科學院腫瘤醫(yī)院實驗證明有望成為低毒、有效的新型天然抗癌藥物，市場十分緊缺。目前產(chǎn)品多從枇杷葉片進行有機提取，成本高。提取方法可見 CN200710008809. 9,200910154645. X,201210057030. 7 等。現(xiàn)有技術(shù)中主要集中在對枇杷的愈傷組織培養(yǎng)和無性快繁體系的建立；對枇杷葉活性成份的提取及其藥理研究。植物細胞懸浮培養(yǎng)途徑生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物是目前中藥生產(chǎn)中的重要技術(shù)路線，但目前在枇杷研究中，尚無建立懸浮培養(yǎng)體系以提取熊果酸等三萜類化合物的報道。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種枇杷細胞懸浮培養(yǎng)方法，來生產(chǎn)天然熊果酸，以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題。—種枇杷細胞懸浮培養(yǎng)方法，細胞懸浮培養(yǎng)基配方為MS基本培養(yǎng)基+0. 5mg/LNAA+3%蔗糖，pH值為6. O ;外界調(diào)控條件為光照條件為400Lux (12h/d)，采用250ml的三角瓶裝液100ml，接種量為40-60g/L · FW，搖床轉(zhuǎn)速為130r/min，采用透氣膜封口，培養(yǎng)18天收獲。由于傳統(tǒng)的枇杷葉熊果酸提取方法存在多種局限性，本專利技術(shù)提供了用于枇杷細胞懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)液以及培養(yǎng)方法。本專利技術(shù)以枇杷幼胚為材料，進行優(yōu)良愈傷組織的誘導(dǎo)，優(yōu)良愈傷組織經(jīng)過多次繼代培養(yǎng)轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基，繼而進行懸浮培養(yǎng)條件的篩選同時檢測目標產(chǎn)物熊果酸的含量，從而建立了枇杷愈傷組織懸浮培養(yǎng)體系，為通過枇杷細胞懸浮培養(yǎng)提取熊果酸的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。其中，采 用最佳方式培養(yǎng)，枇杷細胞培養(yǎng)物中熊果酸的得率為36. 49mg/g *DW。比目前洪燕萍文獻報道中枇杷葉(南亞枇杷)中最高熊果酸的含量(14. 01mg/g · Dff)提高了約 160. 46%。附圖說明圖1為本專利技術(shù)實施例中枇杷細胞懸浮培養(yǎng)生長曲線及熊果酸含量圖。具體實施例方式試驗材料枇杷幼果，采自福建省莆田市果樹研究所。枇杷細胞有效成分熊果酸的提取方法為現(xiàn)有技術(shù)超聲波萃取法，具體為溶劑為95%乙醇，料液比1:30 (g/ml)，超聲波萃取，萃取溫度40°C，萃取頻率為25KHZ，萃取功率260W，提取次數(shù)I次，超聲時間40min。用液相色譜(HPLC)測定。實施例1枇杷愈傷組織的獲得采用現(xiàn)有技術(shù)，從枇杷幼果誘導(dǎo)獲得，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+Img/L2, 4-D+O. 5mg/L KT+蔗糖2%+6. 8g/L瓊脂粉，PH 5. 8，25°C，黑暗培養(yǎng)，同一培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件繼代培養(yǎng)5次后，轉(zhuǎn)入懸浮培養(yǎng)。枇杷細胞懸浮培養(yǎng)體系的建立及培養(yǎng)方法材料選取固體培養(yǎng)基上淡黃色、生長狀態(tài)良好、質(zhì)地疏松、枇杷幼胚誘導(dǎo)而來的胚性愈傷組織。以原有固體培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件(實施例1中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基 +lmg/L 2，4-D+O. 5mg/L KT+蔗糖 2%, PH 5. 8，25°C，黑暗培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速 110r/min)連續(xù)繼代5代以上，獲得均一的懸浮液，以進行后續(xù)的調(diào)控研究(實施例2-9)。調(diào)控研究中所采用的培養(yǎng)液配方及培養(yǎng)條件為MS基本培養(yǎng)基+lmg/L 2, 4-D+O. 5mg/L KT+蔗糖2%，PH5.8，25°C，黑暗培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速110r/min，考察某個因素時，固定其它因素來研究。主要考察指標懸浮培養(yǎng)物鮮重比生長速率、熊果酸含量。收獲時的培養(yǎng)物重量一接神時的培養(yǎng)樹.重量懸浮培養(yǎng)物鮮重比生長速率=.接種時的培養(yǎng)物.重量X 100%熊果酸以超聲波萃取，含量用液相色譜(HPLC)測定實施例2激素對懸浮培養(yǎng)細胞生長和熊果酸含量的影響表12，4D對懸浮培養(yǎng)細胞生長和熊果酸含量的影響權(quán)利要求1.一種用于枇杷細胞懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)液，包括 MS基本培養(yǎng)基；2,4—D 0. 5-6. Omg/L ； NAA 0.5-6. Omg/L ；IBA 0.5-6. Omg/L ；6-BA 0-4. Omg/L ； KT 0-4. Omg/L ； 鹿糖 1-3. 5% ； pH 4. 0-6. 5。2.—種用于枇杷細胞懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)液，其特征在于，MS基本培養(yǎng)基+0. 5mg/LNAA+3% 蔗糖+PH 6. O03.—種枇杷細胞懸浮培養(yǎng)方法，包括如下步驟 (1)培養(yǎng)獲取枇杷愈傷組織； (2)提供權(quán)利要求1或2的枇杷細胞懸浮培養(yǎng)液； (3)愈傷組織在懸浮培養(yǎng)液中進行懸浮培養(yǎng)； (4)收獲細胞，提取熊果酸。4.一種枇杷細胞懸浮培養(yǎng)方法，細胞懸浮培養(yǎng)基配方為MS基本培養(yǎng)基+0. 5mg/LNAA+3%蔗糖，pH值為6. 0 ;外界調(diào)控條件為光照條件為400LuX，12h/d，采用250ml的三角瓶裝液100ml，接種量為40-60g/L FW，搖床轉(zhuǎn)速為130r/min，采用透氣膜封口，培養(yǎng)18天收獲。全文摘要本專利技術(shù)公開了。其中，培養(yǎng)液包括MS基本培養(yǎng)基，2,4-D0.5-6.0mg/L；NAA0.5-6.0mg/L；IBA0.5-6.0mg/L；KT 0-4.0mg/L；BA0-4.0mg/L；蔗糖1-3.5%；pH4.0-6.5。培養(yǎng)方法為愈傷組織在該培養(yǎng)液中培養(yǎng)。本專利技術(shù)建立了枇杷細胞液體培養(yǎng)體系，采用本專利技術(shù)最佳方式培養(yǎng)，枇杷細胞培養(yǎng)物中熊果酸的得率為36.49mg/g·DW。文檔編號C12N5/02GK102994443SQ20121045773公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月14日專利技術(shù)者李惠華, 劉小英, 蘇明華, 王偉, 常強, 陳淳, 徐劍 申請人:福建省亞熱帶植物研究所本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種用于枇杷細胞懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)液，包括：MS基本培養(yǎng)基；2,4?D??0.5?6.0mg/L；NAA????0.5?6.0mg/L；IBA????0.5?6.0mg/L；6?BA???0?4.0mg/L；KT?????0?4.0mg/L；蔗糖???1?3.5%；pH?????4.0?6.5。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李惠華，劉小英，蘇明華，王偉，常強，陳淳，徐劍，
申請(專利權(quán))人：福建省亞熱帶植物研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：