本發明專利技術涉及AFP重組蛋白和體外重組表達的方法，具體涉及一種人工信號肽-AFP-609aa-6his的重組蛋白和哺乳動物瞬時表達系統體外重組表達方法，其蛋白質序列如SEQ?ID?NO:1所示，a.將重組蛋白基因通過雙酶切克隆到pcDNA3.1+載體中，構建pcDNA3.1+-AFP表達質粒，并進行質粒抽提；b.將抽提得到的pcDNA3.1+-AFP質粒用PEI轉染進CHO-S懸浮細胞進行重組蛋白的表達；c.7天后分離純化得到的重組蛋白。本發明專利技術通過大規模瞬時懸浮CHO-S表達系統制備的人工合成AFP蛋白活性跟天然AFP蛋白相近，且得到的純度較高，內毒素含量低，無動物源性蛋白的污染，可以有望作為肝癌免疫治療的腫瘤抗原疫苗。
【技術實現步驟摘要】
一種AFP重組蛋白和體外重組表達的方法本專利技術涉及AFP重組蛋白和體外重組表達的方法，具體涉及一種人工信號肽-AFP-609aa-6his的重組蛋白和哺乳動物瞬時表達系統體外重組表達方法。原發性肝細胞癌(primaryhepatocellular carcinoma，PHC,簡稱肝癌)是常見的惡性腫瘤之一，全球年發病病例大約為120萬人。目前，肝癌治療的總體療效仍很不理想，臨床上肝癌的治療方法主要有外科切除、 肝移植等。外科切除的病人的復發率很高，術后3年復發率為50%，5年復發率為70%。肝移植治療，尤其是活體肝移植雖然取得了一定的進展，但卻面臨著供體來源缺乏等問題。因此，臨床上迫切需要研究和發展新的治療肝癌的方法。近年來，隨著免疫學和分子生物學基礎理論研究的迅猛發展，以及人們對肝癌細胞生物學特性認識的加深，肝癌免疫治療成為新的腫瘤治療方法。目前已知的可能成為肝癌免疫治療的靶抗原有AFP、MAGE家族、HBV/HCV病毒抗原，以及一些癌基因(myc、fos、ras)坐寸οAFP是人體胎兒期血液中出現的一種特殊蛋白質。它在胎兒的肝細胞內合成。 AFP在成人血清中含量極微，但在肝細胞功能發生異常，特別在患有原發性肝細胞癌時，血清中又可出現AFP升高，所以臨床上常常借助AFP的檢查作為原發性肝細胞癌的輔助診斷。50% 80%的肝癌患者表達AFP，并且在血清中的濃度可能超過I mg/ml。在人體發育過程中，T細胞庫內針對AFP的特異性CTL克隆并未清除，適當條件和方法可以將之激活， Butterfield等將4條AFP表位肽包裹在不完全福氏佐劑里，對6例HLA A2.1陽性、表達 AFP的HCC病人進行皮內免疫，5例病人對其中的3條表位肽顯示了 AFP肽特異性T細胞擴增。基礎研究表明，DC是體內功能最強的專職抗原遞呈細胞，但由于肝癌患者體內DC大多數處于不成熟狀態，其功能存在障礙，誘導同種異體淋巴細胞增殖的能力降低。通過體外誘導DC成熟，并負載AFP來源的表位肽，激活特異性CTL殺傷肝癌細胞的能力。哺乳動物表達系統在蛋白的起始信號、加工、分泌、糖基化方面具有獨特優勢，適合表達完整的大分子蛋白。由哺乳動物細胞翻譯后再加工修飾產生的外源蛋白質，在活性方面遠勝于原核表達系統及酵母、昆蟲細胞等真核表達系統，更接近于天然蛋白質。由于近幾年生物技術公司對哺乳動物表達系統的研發，相應的已經推出了較好的表達系統，大大提高了外源蛋白在哺乳系統里的表達量。隨著懸浮系統的日益成熟化，現在大規模瞬時表達外源蛋白已經成功，目前已經能達到mg至g級別。中國倉鼠卵巢細胞CHO作為表達宿主， 其優勢有以下幾點遺傳背景清楚，生理代謝穩定；與人的親緣關系接近，外源蛋白修飾準確；基因轉移和載體表達系統完善；耐受剪切力，便于大規模培養；被美國FDA確認為安全的基因工程受體細胞。為了能夠大規模的制備高純度的AFP蛋白，本專利技術提供一種人工信號肽-AFP-609aa-6his的重組蛋白及其制備的方法。為實現上述目的，設計一種人工信號肽-AFP-609aa_6his的重組蛋白，其特征在于其蛋白質序列如SEQ ID NO:1所示。人工信號肽的堿基序列如SEQ ID NO 2所示。本專利技術還包括一種用哺乳動物瞬時表達系統體外表達所述重組蛋白的方法，包括重組蛋白基因的合成，其特征在于該方法包含以下步驟a.利用基因合成技術，合成人工信號肽-AFP-609aa_6his序列b.將人工信號肽-AFP-609aa_6his基因序列通過雙酶切克隆到pcDNA3. 1+載體中，構建pcDNA3.1+-AFP表達質粒，并進行質粒抽提，C.將抽提得到的PCDNA3.1+-AFP質粒用PEI轉染進CHO-S懸浮細胞進行重組蛋白的表達，d. 7天后分離純化得到的重組蛋白。用N1-柱來分離純化。用Hind III和EcoR I進行所述的雙酶切。上述的重組蛋白能應用于肝癌治療藥物。本專利技術主要包含四個方面的內容(1)利用基因合成技術，合成重組AFP DNA 序列，然后將序列克隆到pcDNA3. 1+載體中，構建pcDNA3.1+-AFP質粒，大規模制備 pcDNA3.1+-AFP質粒；(2)使用CHO懸浮表達系統表達重組AFP蛋白；(3)使用Ni — NTA 柱從懸浮 細胞上清液中分離純化重組AFP蛋白。(4)將純化后AFP蛋白刺激樹突狀細胞 (dendritic cells, DC),用活化后的DC細胞將T細胞激活，形成CTL殺傷H印G2細胞，用 MTT法檢測殺傷率。本專利技術目的通過大規模瞬時懸浮CHO-S表達系統制備的人工合成AFP蛋白活性跟天然AFP蛋白相近，且得到的純度較高，內毒素含量低，無動物源性蛋白的污染，可以有望作為肝癌免疫治療的腫瘤抗原疫苗。[附圖說明]圖1是哺乳動物表達系統的質粒pcDNA3. 1+圖譜，圖2是pcDNA3.1+-AFP的酶切鑒定瓊脂糖電泳圖，圖3是SDS-PAGE分析純化后重組AFP蛋白圖，圖4是Western-blot分析純化后重組AFP蛋白圖，圖5是MTT法檢測經CTL處理的!fepG2細胞生長數據圖。圖1中的圖譜的具體信息為CMV 啟動子(CMV promoter) : bases 232-819T7 啟動子 / 引物綁定位點(Τ7 promoter/priming site) : bases 863-882多克隆位點(Mutiplecloning site) : bases 895-1010反鏈的引物結合位點(pcDNA3.1/BGH reverse priming site): bases 1022-1039BGH 多腺苷酸序列(BGH polyadenylation sequence) : bases 1028-1252fl 復制起始位點(fl origin) : bases 1298—1726sv40 早期啟動子和復制起始位點(SV40 early promoter and origin) : bases 1731-2074新霉素抗性基因(開放讀碼框)Neomycinresistance gene (ORF) : bases 2136-2930SV40 多腺苷酸信號(SV40 polyadenylation signal) : bases 3104-3234PUC 復制起始位點(pUC origin) : bases 3617-4287 (互補鏈 complementary strand)氛卡青霉素抗性基因Ampicillin resistance gene (bla) : bases 4432-5428 (互補鏈 complementary strand)開放讀碼框(ORF): bases 4432-5292 (互補鏈 complementary strand)核糖體結合位點(Ribosomebinding site) : bases 5300-5304 (互補鏈 complementary strand)Bla 啟動子 Bla promoter (P3) : bases 5327-5333 (互補鏈 complementary strand)[具體實施方式]為了使本專利技術的目的、技術方案及優點更加清楚明白，對本專利技術進行進一步本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種人工信號肽?AFP?609aa?6his的重組蛋白，其特征在于其蛋白質序列如SEQ?ID?NO:1?所示。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：陸玲玲，蘇國新，葉永清，
申請(專利權)人：上海柯萊遜生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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