一種特立帕肽醋酸鹽的純化方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種特立帕肽醋酸鹽的純化方法，包括以下步驟：以體積比10%—30%的醋酸和5%—20%的乙腈水溶液溶解粗肽；將粗肽溶液進行梯度洗脫純化，以體積比0.1%—0.4%的硫酸和體積比0.1%—0.4%醋酸的水溶液用氨水調(diào)pH值5.0—6.0后的溶液為A相，乙腈為B相，梯度：B%：20%—40%洗脫；鹽析；用含3%—10%乙腈的醋酸銨溶液沖洗，用十八烷基硅烷鍵合硅膠高效液相色譜進行轉(zhuǎn)鹽，醋酸水溶液乙腈體系洗脫。本發(fā)明專利技術(shù)的目的是提供一種操作簡單、高收率、純度高、有利于實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的特立帕肽的純化方法。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種多肽的純化方法，尤其涉及特立帕肽醋酸鹽的純化方法。
技術(shù)介紹
特立帕肽，英文名Teriparatide,分子式為 C181H292N55O51S2。特立帕肽(pTH( 1-34))是一個34肽，也稱人甲狀旁腺激素(1-34)。特立帕肽是人甲狀旁腺激素(ParathyiOidHormone,human)氨基端的1_34個氨基酸組成的多肽，由美國Eli Lilly公司研發(fā)，以特立帕肽醋酸鹽作為藥品使用，屬于基因重組藥物，2002年被美國FDA批準上市。它是第I個被批準用于治療嚴重骨質(zhì)疏松癥的骨形成促進劑，有較廣泛的市場應用前景。目前涉及到特立帕肽合成的文獻和專利較多，但涉及到純化的較少，特別是本發(fā) 明的反相色譜和鹽析相結(jié)合的規(guī)模化純化制備(一批可得精品200克以上)和高純度且達到藥用級(純度達99. 5%以上，最大單雜O. 1%)更是沒有涉及。現(xiàn)有技術(shù)CN102731643A公開了一種特立帕肽的純化方法，采用水作為溶劑，然后以O. 2%TFA/乙腈為流動相采用C18柱進行純化，然后用O. 2%醋酸/乙腈C18柱轉(zhuǎn)鹽，雖能得到較高純度的特立帕肽醋酸鹽，但總收率只有20%左右，不利于產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)。為解決現(xiàn)有技術(shù)存在收率低的難題，提高特立帕肽醋酸鹽的純化收率，降低生產(chǎn)成本，還需對純化方法進一步的研究。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)提出了，純度高且收率好，達到產(chǎn)業(yè)化要求。為實現(xiàn)上述目的，綜合考慮特立帕肽本身的性質(zhì)，本專利技術(shù)提供的包括以下步驟 步驟I):以體積比10% — 30%的醋酸和5% — 20%的乙腈水溶液按照濃度20g/L — 50g/L溶解粗肽；用水將粗肽溶液中的醋酸與乙腈的體積之和的體積比例稀釋到10% — 30%。步驟I)下文也表述為“前處理”。“粗肽溶液”是指粗肽經(jīng)過前處理后所得到的溶液，所使用的水為純凈水，并符合注射用水標準，優(yōu)選超純水；所使用的醋酸為分析純的冰醋酸，本專利技術(shù)的“乙腈”的純度級別優(yōu)選色譜純。選擇體積比10% — 30%的醋酸和5% — 20%的乙腈水溶液混合溶劑系統(tǒng)是通過對比試驗考慮實際生產(chǎn)過程的操作方便得出的，不在該濃度的溶劑溶解的濃度會變低，導致樣品溶解體積過大，不利于反相色譜的處理(會導致體積過載，純化效率低)。現(xiàn)有技術(shù)CN102731643A采用水作為溶劑，其會影響純化洗脫系統(tǒng)所使用有機溶劑的濃度，需要洗脫系統(tǒng)較長時間來平衡色譜柱，采用其他溶劑溶解粗肽會引入新的溶劑(導致成品引入新的有機溶劑殘留，影響成品質(zhì)量。將制備的粗肽的濃度控制在20g/L — 50g/L有利于純化效率，高于50g/L會導致后續(xù)的反相色譜純化時不掛色譜柱，低于20g/L會使純化效率低下。用水將粗肽溶液中的醋酸與乙腈的體積之和的體積比例稀釋到10% — 30%，當醋酸和乙腈的比例高于30%此范圍的溶劑會導致后續(xù)的反相色譜純化時不掛色譜柱，當醋酸和乙腈的比例低于10%會使樣品析出，導致后續(xù)的反相色譜純化無法進行。步驟2):將粗肽溶液進行梯度洗脫純化，以O. 1%—O. 4%的硫酸和O. 1% — O. 4%醋酸水溶液(體積比，用氨水調(diào)PH值5. O — 6. O，優(yōu)選5. 5)為A相，乙腈為B相，梯度B% 20%—40% ;步驟2)下文也表述為“純化”。選擇O. 1%—O. 4%的硫酸和O. 1%—O. 4%醋酸兩種酸用氨水調(diào)節(jié)后生成兩種緩沖鹽的A相是優(yōu)化選擇的結(jié)果，較現(xiàn)有技術(shù)CN102731643A采用O. 2%TFA具有更好的分離效果。流動相A中緩沖鹽的濃度低于所限定的范圍使流動相緩沖能力變?nèi)酰瑢е聵悠凡荒芡耆疵撉易V圖變形達不到分離的要求。大于此范圍，流動相A中緩沖鹽的濃度過高對色譜系統(tǒng) 損傷較大，甚至會部分產(chǎn)生鹽析，導致無法純化。另外，流動相A的pH值也非常重要，不在5. 0—6. O范圍達不到分離效果。洗脫系統(tǒng)中A相和B相的比例是通過大量實驗篩優(yōu)選得到的，B%低于20%樣品不能沖洗下色譜柱，B%大于40%樣品會提前沖出，都不能進行純化。采用該溶劑系統(tǒng)純化，分離效果較現(xiàn)有技術(shù)會大幅提高，本步的收率90%左右，所得樣品的純度在95%以上，大大提高收率和純度，降低了生產(chǎn)成本。所述“粗肽”是指采用液相合成法或固相合成法得到的，尚未經(jīng)過精制處理的特立帕肽粗肽或者純度不能滿足藥用的特立帕肽，粗肽中特立帕肽的純度在20%以上，采用現(xiàn)有技術(shù)方法CN102731643A的方法較難實現(xiàn)該濃度產(chǎn)品的純化。所述步驟2)中所使用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度優(yōu)選為5 cm X 25 cm, 10 cm X 25 cm 或 30 cm X 25 cm。步驟3)采用鹽析的方法對其進行進一步的純化，使其純度達到99%以上。步驟3)下文也表述為“鹽析”。所述“鹽析”是指通過控制步驟2)所得合格溶液的乙腈濃度和溶液的pH值，使樣品析出的過程(所述合格溶液是指純度大于95%的樣品)。鹽析的優(yōu)選方法為通過常溫旋蒸的方法將步驟2)所得合格溶液中乙腈的比例降至10%以下，再將其pH值用20%的稀氨水調(diào)至5. 5-7. O后放置到2-8攝氏度2小時以上，使其析出。再將渾濁液進行離心處理，上清液作為廢液處理；下層固體用體積比濃度50%-100%的磷酸水溶液將其溶解后，再用注射用水稀釋一倍后轉(zhuǎn)入步驟4)即可。所述步驟3)中，所得合格溶液中乙腈的比例降至10%以下，再將其pH值用20%的稀氨水優(yōu)選調(diào)至6. 5 ;放置到2-8攝氏度2小時以上，使其析出；再將渾濁液進行離心處理，上清液作為廢液處理；下層固體優(yōu)選用60%的磷酸水溶液將其溶解后，再用注射用水稀釋一倍后轉(zhuǎn)入步驟4)。采用該pH值及相應濃度的磷酸水溶液具有更好的鹽析效果。該步驟提高樣品的純度，將特立帕肽的純度從大于95%到大于99. 0%。另外，使用鹽析方法較CN102731643A具有很大的成本優(yōu)勢，鹽析的成本遠遠低于反相色譜處理的成本，特別是在規(guī)模化生產(chǎn)時尤為明顯。步驟4)采用反相高效液相色譜法將特立帕肽的硫酸鹽轉(zhuǎn)成醋酸鹽。步驟4)下文也表述為“轉(zhuǎn)鹽”。所述“反相高效液相色譜”的固定相為八烷基硅烷鍵合硅膠，轉(zhuǎn)鹽的方法優(yōu)選為用含3% —10%乙腈的醋酸銨溶液沖洗15 — 30min，醋酸銨溶液的濃度為O. 1% — O. 8%，優(yōu)選O. 3% ;然后用醋酸水溶液乙腈體系洗脫，所述醋酸水溶液的濃度為O. 1% — O. 4%，優(yōu)選為O.2%。該洗脫步驟所采用的乙腈濃度為40%以上，收集特立帕肽溶液，濃縮，冷凍干燥后得特立帕肽醋酸鹽。所述步驟4)中所使用以八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度優(yōu)選為5 cm X 25 cm, 10 cm X 25 cm 或 30 cm X 25 cm。本專利技術(shù)提供的純化特立帕肽方法操作可行、純度高(可達99. 0%以上且最大單雜小于O. 1%)、收率高(純化收率可達80%以上)，達到產(chǎn)業(yè)化要求(一批次可獲得200克以上的精妝)。本專利技術(shù)采用反相色譜和鹽析結(jié)合的辦法進行純化處理，有利于濃度在20%左右的粗肽樣品的純化，較CN102731643A具有很大的成本優(yōu)勢(鹽析的成本遠遠低于反相色譜處 理的成本)，特別是在規(guī)模化生產(chǎn)時尤為明顯。另外本專利技術(shù)得到的特立帕肽純度較高可達99. 5%以上，且任一單雜均小于O. 1%，完全本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種特立帕肽醋酸鹽的純化方法，包括以下步驟：步驟1）：以體積比10%—30%的醋酸和5%—20%的乙腈水溶液按照濃度20g/L—50g/L溶解粗肽；用水將粗肽溶液中的醋酸與乙腈的體積之和的體積比例稀釋到10%—30%；?步驟2）：將粗肽溶液以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱進行梯度洗脫純化，將體積比0.1%—0.4%的硫酸和體積比0.1%—0.4%醋酸的水溶液用氨水調(diào)pH值5.0—6.0后的溶液為A?相，乙腈為B相，梯度：B%：20%—40%；步驟3）：將步驟2）所得合格溶液中乙腈的比例降至10%以下，再將其pH值用20%的稀氨水調(diào)至5.5—7.0后放置到2—8攝氏度2小時以上，使其析出，再將渾濁液進行離心處理，上清液作為廢液處理；下層固體用50%—100%的磷酸水溶液將其溶解后，再用注射用水稀釋一倍；步驟4）：用八烷基硅烷鍵合硅膠進行高效液相轉(zhuǎn)鹽，將步驟3）所得溶液用含3%—10%乙腈的醋酸銨溶液沖洗15—30min，醋酸銨溶液的濃度為0.1%—0.8%，然后用醋酸水溶液乙腈體系洗脫，收集特立帕肽溶液，所述醋酸水溶液中的醋酸的體積比濃度為0.1%—0.4%，該洗脫步驟所采用的乙腈濃度為40%以上。...

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：趙忠衛(wèi)，劉建，馬亞平，袁建成，
申請(專利權(quán))人：深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：