一種乙型肝炎病毒的分離方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種乙型肝炎病毒的分離方法。擬采用免疫沉淀技術(shù)尋找肝細(xì)胞表面HBV?PreS1結(jié)合蛋白，通過蛋白質(zhì)時(shí)間飛行質(zhì)譜和生物信息學(xué)方法分離和鑒定該受體基因，進(jìn)一步克隆候選受體基因，從分子水平上探討病毒受體本質(zhì)，揭示病毒與宿主細(xì)胞受體之間的關(guān)系從而實(shí)現(xiàn)分離和鑒定。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
—種乙型肝炎病毒的分離方法
本專利技術(shù)涉及，尤其是HBV具有嚴(yán)格的宿主易感性和嗜肝性，感染早期HBV表面抗原特定肽段與肝細(xì)胞上特異受體識(shí)別并結(jié)合，介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞，啟動(dòng)HBV的復(fù)制周期。因此病毒的受體是HBV進(jìn)入肝細(xì)胞的門戶，阻斷HBV與其受體的結(jié)合是治療乙型肝炎的重要途徑之一。
技術(shù)介紹
乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)感染是當(dāng)前嚴(yán)重的全球健康問題之一， 目前全世界約有3. 5億人感染HBV，占全部人口的6 %。其中相當(dāng)一部分感染者發(fā)展為慢性肝炎，少數(shù)還發(fā)展為肝硬化。慢性乙型肝炎至今仍缺乏有效的控制手段和徹底解決方案，臨床常用的抗病毒藥物療效有限，不能有效阻斷HBV在肝組織內(nèi)的復(fù)制和再感染。HBV與肝細(xì)胞之間相互作用分子機(jī)制的研究進(jìn)展相對(duì)滯后是嚴(yán)重影響新型治療方法和藥物研發(fā)的重要原因之一。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問題是提供，它從目前已有對(duì) HBV感染早期過程的研究結(jié)果來看，因缺乏合適的體外感染模型，對(duì)HBV感染的早期過程， 如病毒如何結(jié)合靶細(xì)胞上的受體并最終進(jìn)入細(xì)胞等機(jī)制，仍不清楚。為解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)所采用技術(shù)方案是由于HBV PreSl區(qū)是病毒吸附肝細(xì)胞最重要的附著部位，本方法擬采用免疫沉淀技術(shù)直接尋找原代人肝細(xì)胞表面HBV PreSl結(jié)合蛋白，即候選受體，進(jìn)一步克隆其基因，研究候選受體功能從而實(shí)現(xiàn)鑒定的方法。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)的有益效果是從分子水平上探討病毒受體的本質(zhì)，從而揭示病毒與宿主細(xì)胞受體之間的關(guān)系。對(duì)抗病毒疫苗及抗病毒藥物設(shè)計(jì)產(chǎn)生重大影響。具體實(shí)施方式1、通過PCR方法擴(kuò)增PreSl不同基因片斷，克隆入帶Flag標(biāo)簽的真核細(xì)胞分泌型表達(dá)載體pCMV-CFT，進(jìn)一步分離純化Flag-PreSl融合蛋白。2、取行部分肝葉切除術(shù)患者的正常肝組織(約40g左右)，按照Protzer U等報(bào)道的兩步膠原酶灌注法分離肝細(xì)胞，培養(yǎng)鑒定。3、用純化表達(dá)的Flag-PreSl融合蛋白與人原代肝細(xì)胞(primary human hepatocyte, PHH)裂解物充分孵育，融合蛋白與肝細(xì)胞膜上結(jié)合蛋白復(fù)合物可通過與 FITC-標(biāo)記的抗Flag單抗(Sigma)特異性結(jié)合，通過流式細(xì)胞儀檢測鑒定融合表達(dá)的HBV PreSl片段對(duì)PHH的細(xì)胞結(jié)合活性。權(quán)利要求1.2.PHH用-甲硫氨酸代謝標(biāo)記，并與純化的Flag-PreSl融合蛋白免疫共沉淀，結(jié)合蛋白復(fù)合物行SDS-PAGE電泳,并與抗Flag單抗(Sigma)特異性結(jié)合,Western雜交檢測特異結(jié)合蛋白大小。3.將SDS-PAGE分離純化的結(jié)合蛋白行時(shí)間飛行質(zhì)譜分析，并在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中用生物信息學(xué)方法分析，進(jìn)一步確定候選蛋白序列。全文摘要本專利技術(shù)涉及。擬采用免疫沉淀技術(shù)尋找肝細(xì)胞表面HBV PreS1結(jié)合蛋白，通過蛋白質(zhì)時(shí)間飛行質(zhì)譜和生物信息學(xué)方法分離和鑒定該受體基因，進(jìn)一步克隆候選受體基因，從分子水平上探討病毒受體本質(zhì)，揭示病毒與宿主細(xì)胞受體之間的關(guān)系從而實(shí)現(xiàn)分離和鑒定。文檔編號(hào)G01N27/62GK102993294SQ201110278440公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2011年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月19日專利技術(shù)者冉兵 申請(qǐng)人:冉兵本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種乙型肝炎病毒的分離方法

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：冉兵，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：冉兵，
類型：發(fā)明
國別省市：