制備美登木素生物堿抗體綴合物的方法技術

本發明專利技術涉及一種制備美登木素生物堿抗體綴合物的方法。本發明專利技術提供的制備與細胞毒性劑化學偶聯的抗體的方法包括使連接體與抗體共價連接、純化步驟、使細胞毒性劑與抗體綴合和隨后的純化步驟。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及制備相當高純度和穩定性的綴合物的方法，其中所述綴合物包含與藥物化學偶聯的細胞結合劑。
技術介紹
隨著更有效地靶向并殺滅癌細胞的藥物開發，癌癥治療取得顯著的進步。為了這個目的，研究人員利用癌細胞選擇性表達的細胞表面受體和抗原，來開發基于抗體的藥物，所述抗體與腫瘤特異性或腫瘤相關性抗原結合。在這點上，已將細胞毒性分子例如細菌和植物毒素、放射性核素和某些化學治療藥物與單克隆抗體化學連接，所述單克隆抗體與腫 瘤特異性或腫瘤相關性抗原結合(參見，例如，國際專利申請WO 00/02587、WO 02/060955和WO 02/092127，美國專利5，475,092,6, 340，701和6，171，586，美國專利申請公布號2003/0004210A1，和 Ghetie 等，J.1mmunol. Methods, 112:267-277 (1988))。通常將這類化合物分別稱為毒素、放射性核素和藥物“綴合物”。常常也將它們稱作免疫綴合物、放射免疫綴合物和免疫毒素。在藥物綴合物與腫瘤細胞結合并釋放藥物或/和激活藥物的細胞毒活性時，發生腫瘤細胞殺滅。藥物綴合物所提供的選擇性使對正常細胞的毒性降到最低，因此提高了藥物在患者中的耐受性。先前已經描述了將抗體與含巰基的細胞毒性劑例如美登木素生物堿綴合的方法(參見，例如，美國專利5，208，020、5，416，064和6，441，163)。例如，美國專利5，208，020和5，416，064公開了制備抗體-美登木素生物堿綴合物的方法，其中首先用異雙功能試劑(例如美國專利4，149,003,4, 563，304和美國專利申請公布號2004/0241174A1中所述的)修飾抗體。美國專利5，208，020和5，416，064進一步描述了經修飾的抗體與過量的含巰基的細胞毒性劑在PH 7的綴合，隨后經S印hadex G25色譜柱純化。也描述了用尺寸排阻色譜法(SEC)純化抗體一藥物綴合物(參見,例如，Liu等，Proc. Natl. Acad. Sci(USA)，93:8618-8623(1996)和 Chari 等，Cancer Research, 52:127-131 (1992))。先前描述用于制備抗體一藥物綴合物的方法是復雜的，因為它們被用于執行或生產免疫綴合物的累贅步驟所阻礙，與最佳期望的相比，所述免疫綴合物純度更低或更不穩定。例如，在pH為6. O 6. 5之間的綴合對于生產純凈和穩定的綴合物來說不是最佳的。此外，在這些條件下的綴合反應通常是緩慢和無效率的，導致需要應用過度的時間和材料。改變或消除一個或多個制備步驟，而不損害產物質量例如純度和/或穩定性，將是理想的。進一步理想的是，具有除迄今為止所述的那些之外的另外的純化選擇，因為一些使用細胞結合劑、連接體和藥物的某些組合的選擇比使用其它的將更有效。鑒于前文所述，在本領域中存在如下需求開發改進的制備具有相當高純度和同時具有更大穩定性的細胞結合劑-藥物綴合物組合物的方法。本專利技術提供這樣的方法。根據本文提供的本專利技術的說明，本專利技術的這些和其它優點以及另外的專利技術特征將是明顯的。
技術實現思路
專利技術簡要概述本專利技術提供一種制備相當高純度和穩定性的綴合物的方法，該綴合物包含與藥物化學偶聯的細胞結合劑。該方法包括(a)用雙功能交聯試劑與細胞結合劑接觸，以使連接體與細胞結合劑共價連接，從而制備第一混合物，該混合物包含其上結合了連接體的細胞結合劑，(b)使第一混合物經受切向流過濾、吸附色譜法、吸附過濾、選擇性沉淀或它們的組合，從而制備純化的其上結合了連接體的細胞結合劑的第一混合物，(c)通過在pH為大約4至大約9的溶液中將其上結合了連接體的細胞結合劑與藥物起反應，以制備第二混合物，該混合物包含(i)通過連接體與藥物化學偶聯的細胞結合劑、(ii)游離藥物和(iii)反應副產物，來使藥物與純化的第一混合物中其上結合了連接體的細胞結合劑綴合，以及(d) 使第二混合物經受切向流過濾、吸附色譜法、吸附過濾、選擇性沉淀或它們的組合，以從第二混合物的其它成分中純化通過連接體與藥物化學偶聯的細胞結合劑，從而制備純化的第二混合物。專利技術詳述本專利技術提供一種制備相當高純度和穩定性的細胞結合劑-藥物綴合物的方法。這樣的組合物因為該綴合物的高純度和穩定性可用于治療疾病。包含細胞結合劑例如與藥物如美登木素生物堿化學偶聯的抗體的組合物描述于例如美國專利申請公布號2004/0241174A1中。在本上下文中，相當高純度被認為是(a)大于90%，優選大于95%的綴合物種類為單體，和/或(b)綴合物制備物中游離藥物水平小于2%(相對于總藥物)。在這方面，本專利技術的方法包括(a)用雙功能交聯試劑修飾細胞結合劑，以使連接體與細胞結合劑共價連接，從而制備第一混合物，該混合物包含其上結合了連接體的細胞結合劑，(b)使第一混合物經受切向流過濾、吸附色譜法、吸附過濾、選擇性沉淀或它們的組合，以從第一混合物的其它成分中純化其上結合了連接體的細胞結合劑，從而制備純化的其上結合了連接體的細胞結合劑的第一混合物，(c)通過在pH為大約4至大約9的溶液中使其上結合了連接體的細胞結合劑與藥物起反應，以制備第二混合物，該混合物包含(i)通過連接體與藥物化學偶聯的細胞結合劑、(ii)游離藥物和(iii)反應副產物，來使藥物與純化的第一混合物中其上結合了連接體的細胞結合劑綴合，和(d)使第二混合物經受切向流過濾、吸附色譜法、吸附過濾、選擇性沉淀或它們的組合，以除去非綴合的藥物、反應物和副產物以及獲得相當純化的細胞結合劑-藥物綴合物。優選地，在純化步驟中利用切向流過濾(TFF，也稱為交叉流過濾、超濾和滲濾)和/或吸附色譜法樹脂。然而，當TFF用于第一個純化步驟(步驟b)中，在(步驟c)中綴合應用的PH為6. 0-6. 5，并且于第二個純化步驟(步驟d)中應用吸附色譜法樹脂時，優選吸附色譜法樹脂為非離子交換樹脂。在另一個優選的實施方案中，TFF用于兩個純化步驟中，或吸附色譜法樹脂用于兩個純化步驟中。替代選擇地，吸附色譜法樹脂用于第一個純化步驟中，和TFF用于第二個純化步驟中。TFF和吸附色譜法樹脂的組合也可用于第一個和/或第二個純化步驟中。可以利用任何適合的TFF系統,包括Pellicon型系統(Mi 11 ipore, Billerica, MA)、Sartocon Cassette 系統(Sartorius AG, Edgewood, NY)和Centrasette 型系統(Pall Corp. , East Hills, NY)。可以利用任何適合的吸附色譜法樹脂。優選的吸附色譜法樹脂包括用于羥磷灰石色譜法、疏水電荷誘導色譜法(HCIC)、疏水作用色譜法(HIC)、離子交換色譜法、混合式離子交換色譜法、固定化金屬離子親和色譜法(IMAC)、染料配體色譜法、親和色譜法、反相色譜法及其組合的樹脂。適用的羥磷灰石樹脂的實例包括陶瓷輕憐灰石(I 型和 II 型 CHT, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)> HA Ultrogel羥磷灰石(Pall Corp. , East Hills, NY)和陶瓷氟磷灰石(I型和II型CFT，Bio-RadLabor本文檔來自技高網...

【技術保護點】
制備抗體?細胞毒性劑綴合物的方法，該方法包括下列步驟：(a)用雙功能交聯試劑接觸抗體，以使連接體與抗體共價連接，從而制備第一混合物，該混合物包含其上結合了連接體的抗體,(b)通過在pH為大約4至大約9的溶液中使其上結合了連接體的抗體與細胞毒性劑起反應，使細胞毒性劑與第一混合物中其上結合了連接體的抗體綴合，以制備第二混合物，該混合物包含(i)通過連接體與細胞毒性劑化學偶聯的抗體，(ii)游離細胞毒性劑和(iii)步驟(b)期間產生的反應副產物，以及(c)使第二混合物經受切向流過濾、選擇性沉淀、吸附過濾、吸附色譜法或其組合，以從第二混合物的其它成分中純化通過連接體與細胞毒性劑化學偶聯的抗體，從而制備純化的通過連接體與細胞毒性劑化學偶聯的抗體的第二混合物；其中所述第一混合物不經受純化。

【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發人員：戴勇，王勇，晉圣瑾，D·H·梅舒拉姆，G·W·阿姆弗萊特，
申請(專利權)人：伊繆諾金公司，
類型：發明
國別省市：