非酒精性脂肪肝小鼠模型的造模加工方法技術

本發明專利技術公開了一種非酒精性脂肪肝模型小鼠的造模方法，其特征在于：包含以下步驟：（1）取健康小鼠，先在動物房內進行適應性飼養3-7天，每天更換鼠籠墊料和清水，在此期間飼喂基礎飼料；（2）適應性飼養后，每日飼喂復合高脂飼料；（3）兩周后給小鼠進行腹腔注射濃度5%CCl4液，用去離子水將液體四氯化碳稀釋至濃度為5%的乳濁液，每次腹腔注射均需新鮮配制方可；腹腔注射狀態持續至第28天，同時飼喂復合高脂飼料；即得。此造模方法歷時短、造模成功率高、死亡率極低、成本低。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種動物模型的造模工藝，特別涉及一種非酒精性脂肪肝小鼠模型新型工藝。
技術介紹
隨著人們生活水平的提高，飲食結構有了明顯的改變，被稱為“富貴病”的脂肪性肝病(也稱脂肪肝)發病率明顯提高，尤其是在亞洲。已成為僅次于病毒性肝炎的第二大高發性肝病。脂肪肝由多種誘因引起，病變主體在肝小葉，是常見的彌漫性肝病之一，以肝細胞內甘油三酯(TG)蓄積過多和彌漫性肝細胞脂肪變性為主要病理特性。臨床上根據是否有過量酒精攝入，將脂肪肝分為酒精性脂肪肝病(alcoholic fatty liver disease, AFLD)和非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)。非酒精性脂肪肝病 較為復雜化，如若不及時加以控制，從而會導致炎癥反應和肝纖維化發生。它是一種無過量飲酒史，以肝細胞脂肪變性等特征的病理綜合征，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性纖維化和脂肪性肝硬化4個病理過程。針對該病理過程，各醫療醫學研究機構都在研究治療非酒精性脂肪肝病的特效藥，在此背景下無論是新藥的安全性評價還是療效都需要有動物模型進行檢測。非酒精性脂肪肝小鼠模型的高效造模方法就顯得格外重要了。目前市場沒有出售具有穩定遺傳性的非酒精性脂肪肝模型小鼠，都是需要后天培養改造的。針對于不同的造模方法，得出模型小鼠的時間也就長短不一。一般造非酒精性脂肪肝模型的方法原理主要從兩方面同時進行。即四氯化碳的腹腔注射可以導致肝臟的急性損傷，再配合著復合高脂飼料導致肝臟的病變，主要表現在肝細胞膜被四氯化碳破損，高脂飼料中的高熱量以脂肪滴的形式進入。在上述研究中，全部是以高脂飼料及四氯化碳的量和時間的堆積而成。只求結果而不顧成本和效率，導致造模成功率低下，死亡率上升并且造模的整個過程時間冗長。且傳統的造模方式為提高高脂飼料的熱量將豬油成分比值提高，加蔗糖少量，再配合其他藥物與基礎飼料混合壓制成條。剛開始小鼠食欲還是比較大的，但是由于豬油含量太高容易產生飽腹感及油膩感導致小鼠食欲不振食量明顯下降，從而拉長的造模的時間。傳統造模方法還有一弊端，即四氯化碳每次注射劑量為10%，每次0.2ml。四氯化碳濃度高了可以有效導致肝細胞的損壞，但是小鼠體質較弱或狀態不好該劑量的腹腔注射很容易導致模型動物的猝死。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種非酒精性脂肪肝模型小鼠的造模方法及應用，它在制備獲得動物模型的同時，能有效縮短造模時間節約造模成本。本專利技術的技術方案一種非酒精性脂肪肝模型小鼠的造模方法，包含以下步驟 (I)取健康小鼠，先在動物房內進行適應性飼養3-7天，每天更換鼠籠墊料和清水，在此期間飼喂基礎飼料；(2)適應性飼養后，每日飼喂復合高脂飼料； (3)兩周后給小鼠進行腹腔注射濃度5%CCl4液，用去離子水將液體四氯化碳稀釋至濃度為5%的乳濁液，每次腹腔注射均需新鮮配制方可；腹腔注射狀態持續至第28天，同時飼喂復合高脂飼料；即得。所述的復合高脂飼料，其配方為2%膽固醇+0. 5%膽酸鈉+0. 2%丙基硫氧嘧啶+5%焦糖+10%豬油+82. 3%基礎飼料。所述的按小鼠的重量計，四氯化碳的注射劑量為O. lml/10go所述的在動物房內飼養，室內溫度保持在18°C 29°C，相對濕度在40 70%，保證環境清潔空氣流通。本專利技術的有益效果與現有技術相比，本專利技術采用蔗糖高溫化為焦糖后代替了傳 統聞脂詞料中的鹿糖，此法提聞了復合聞脂詞料特有的香氣，從而刺激|旲型小鼠的食欲，解決了傳統高脂飼料降低模型小鼠食欲的問題，并且焦糖香味掩蓋了豬油冷卻后的油膩味道。焦糖還可以增長鏈脂肪酸的合成，從而使甘油三酯的合成增加。本專利技術把傳統腹腔注射的10%CC14液換5% CCl4液并分為兩次注射，大大降低了造模的死亡率，并且達到造模死亡率為0%的理想狀態。本專利技術方法簡單，容易實施，成本低廉，使用效果好，具有較大的應用推廣前景。附圖說明圖I為非酒精性脂肪肝模型小鼠肝勻漿檢測結果； 圖2為非酒精性脂肪肝模型小鼠血清檢測結果。具體實施例為了證明該種非酒精性脂肪肝模型小鼠的造模方法的有效性，因此進行了以下實驗 模型小鼠與正常小鼠的血清TC、TG含量比對 I、購買具有動物號的昆明種清潔級的小鼠24只，雌雄各半，體重在18g左右的。購買到實驗室后先進行適應性飼養3天到一周左右，看小鼠情況而定。狀況良好適應3天即可，否則要延長7天。7天時狀況還不佳(指不夠活潑好動的)則廢棄不投入實驗，因為昆明種小鼠比較活潑好斗，尤其是雄性小鼠。每天更換鼠籠墊料和清水，在此期間飼喂基礎飼料。動物適應環境后隨機分為兩組，一組為正常對照組一組為模型組。每組12只雌雄各6只，每組雌雄小鼠分開飼養，每個鼠籠里6只小鼠。2、在動物房內飼養，室內溫度保持在18 °C 29 °C，相對濕度在40 70%，保證環境清潔空氣流通。3、空白對照組每日飼喂基礎鼠飼料，模型組每日飼喂復合高脂飼料，其配方為2%膽固醇+0. 5%膽酸鈉+0. 2%丙基硫氧嘧啶+5%蔗糖(高溫下轉化為焦糖后使用)+10%豬油+82. 3%基礎飼料。按此方法飼喂兩周。4、兩周后給模型組小鼠進行腹腔注射濃度5% CCl4液，用去離子水將液體四氯化碳稀釋至濃度為5%的乳濁液(因為四氯化碳不溶于水)。每次腹腔注射均需新鮮配制方可。將模型小鼠精確稱量后以其質量多少按照每IOg腹腔注射O. Iml的原則換算注射每只模型小鼠的腹腔注射劑量。腹腔注射狀態持續至第28天，同時飼喂復合高脂飼料。5、28天后，停止所有操作將兩組實驗小鼠停食不停水24h，24h后對兩組小鼠精確稱重并記錄，采血。小鼠稱重后放入小鼠尾靜脈注射固定器，從其尾部采血。75%的酒精擦拭尾部后，注射器針頭扁平刺進血管，每只小鼠抽取O. 2ml O. 3ml，抗凝血劑用O. 9%的生理鹽水即可。若有渾濁則冷凍離心(3500r/min，lOmin)，取上清液待用。6、取血后將小鼠移出固定器，提起其尾部旋轉七八圈，放其至摩擦力大的平面上。由于小鼠被轉有暈眩感而趴在桌面上不能動，此時拉其尾部和頭部以頸椎脫白法處死。待其不動立即解剖，此時小鼠的心臟還在搏動，取新鮮肝臟經生理鹽水漂洗后用濾紙吸去表面的水分，立即稱重記錄。7、取肝臟中葉，剪取IOOmg加9倍體積的異丙醇，在冰上研磨成10%肝勻漿，4°C提取24h，離心(3000r/min)，提取上清液待用。用甘油三酯試劑盒、膽固醇試劑盒分別檢測兩組實驗小鼠的血清和肝勻漿。兩者 均在檢測波長500nm處測定光吸收值(OD值)。統計分析處理數據如下圖I和圖2所示。根據圖I可以得知，模型組的小鼠在第29天時，肝系數、甘油三酯含量以及膽固醇含量較正常對照組小鼠均嚴重超標。整個造模時間只用了 28天即成，其中無一小鼠死亡。權利要求1.一種非酒精性脂肪肝模型小鼠的造模方法，其特征在于包含以下步驟 (1)取健康小鼠，先在動物房內進行適應性飼養3-7天，每天更換鼠籠墊料和清水，在此期間飼喂基礎飼料； (2)適應性飼養后，每日飼喂復合高脂飼料； (3)兩周后給小鼠進行腹腔注射濃度5%CCl4液，用去離子水將液體四氯化碳稀釋至濃度為5%的乳濁液，每次腹腔注射均需新鮮配制方可；腹腔注射狀態持續至第28天，同時飼喂復合高脂飼料；即本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種非酒精性脂肪肝模型小鼠的造模方法，其特征在于：包含以下步驟：（1）取健康小鼠，先在動物房內進行適應性飼養3?7天，每天更換鼠籠墊料和清水，在此期間飼喂基礎飼料；（2）適應性飼養后，每日飼喂復合高脂飼料；（3）兩周后給小鼠進行腹腔注射濃度5%?CCl4液，用去離子水將液體四氯化碳稀釋至濃度為5%的乳濁液，每次腹腔注射均需新鮮配制方可；腹腔注射狀態持續至第28天，同時飼喂復合高脂飼料；即得。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳祥盛，薛琰，肖思衛，
申請(專利權)人：貴州大學，
類型：發明
國別省市：