本發明專利技術涉及一種可用于評估藥物治療效果的Luc-LLC腫瘤模型及其建立與應用，所述腫瘤模型通過采用基因重組技術和慢病毒感染將螢火蟲熒光素酶基因引入人肺腺癌LLC細胞株中，通過亞克隆篩選獲得穩定表達熒光素酶的腫瘤克隆細胞株，然后采用重組的LLC細胞接種于小鼠構建而成。本發明專利技術與傳統的腫瘤模型藥物效果檢測方法相比，觀察更加直觀方便，并且可進行活體觀察而不損傷動物，結果更加可靠，具有良好的應用前景。
【技術實現步驟摘要】
可用于評估藥物治療效果的Luc-LLC腫瘤模型及其建立與應用
本專利技術屬于腫瘤模型及其建立與應用領域，特別涉及一種可用于評估藥物治療效果的Luc-LLC腫瘤模型及其建立與應用。
技術介紹
肺癌是威脅我國人民健康的頭號殺手。據衛生部發布的《2010年中國衛生統計年鑒》，我國2009年惡性腫瘤在所有疾病死亡原因中居首位，統計資料顯示死亡率排名前十位的惡性腫瘤中，肺癌居首位，為我國的社會發展帶來嚴重的經濟負擔。近年來，肺癌的治療和基礎研究取得了較大發展，但目前肺癌藥物的基礎和臨床前研究尚欠缺一種能更方便的評估藥物療效的可靠的體內、體外研究平臺，這嚴重制約了肺癌的基礎和臨床前研究。肺癌動物模型是肺癌研究的重要手段，移植性肺癌模型是目前臨床前藥物實驗最常用的模型。 移植型肺癌模型是將人肺癌細胞移植到動物體內傳代生長，移植的腫瘤細胞形態學特征、 染色體數量、同工酶水平等將保持不變，對臨床抗癌藥物敏感性也大致相同，移植型肺癌模型建立的常用方法是皮將肺癌細胞或組織塊接種于裸鼠或其他免疫缺陷小鼠的皮下(腋部、背部、后肢等)建立肺癌模型。此模型建模簡單易行，成瘤率高，易監視腫瘤生長情況， 所以常用來作抗癌藥物篩選的動物模型，同時該模型還具有動物來源方便、移植腫瘤細胞生長迅速、倍增時間短、耗費低等優點。但目前應用的移植型肺癌模型對藥物療效的評估多需采取解剖的方法進行評估，操作復雜，受人為操作的影響因素大，不便于臨床前研究。如果能夠建立一種整體可視化肺癌模型，能夠直接進行體外成像監測評估腫瘤的生長轉移情況，可以對活體動物進行觀察，將大大便利肺癌的臨床前研究，同時也能減少人為因素的干擾，提高評估的準確性。熒光素酶報告基因(Luc)的應用便利了肺癌整體可視化動物模型的構建。熒光素酶報告基因根據來源不同主要分為細菌熒光素酶(Bacterial luciferase, BL)、螢火蟲熒光素酶(firefly Iuciferase1FL)以及海星、發光魚、發光甲蟲等為來源的熒光素酶，目前研究最廣泛并且成為商品酶的是BL和FL。BL是由2個多肽亞基組成的異二聚體，相對分子質量約為79xl03。在還原性黃素(FMNH)、八碳以上長鏈脂肪醛(RCHO)和氧分子(O2)存在時，發射出藍綠光(45(T490nm)。FL由單一的多肽鏈組成，相對分子質量為(60 64) XlO3, 在Mg2+、ATP、O2存在時催化D-熒光素(D-Luciferin)氧化脫羧發光(55(T580nm)。螢火蟲的熒光素-熒光素酶系統是最早建立的發光模型之一，該發光系統采用熒光素底物發光的形式，不需要激發光，具有較高的靈敏度，此外，螢火蟲熒光素酶發出的光組織吸收少，有利于深部組織成像，并且光的強度與標記細胞數量呈線性相關。通過基因工程方法構建熒光素酶的真核表達載體并轉染到癌細胞中，使其表達螢火蟲熒光素酶，進而利用表達熒光素酶的癌細胞接種至動物即可構建整體可視化腫瘤模型，可通過體外成像的方法，對動物體進行活體觀察而不損傷動物。慢病毒感染較其他轉染方式具有較強的優勢，具有感染譜廣、效率高、可感染非分4裂細胞、并可使目的基因穩定整合至宿主基因組因而能夠長期表達、免疫反應小等特點，是一種高效的基因轉移工具。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是提供一種可用于評估藥物治療效果的Luc-LLC腫瘤模型及其建立與應用，與傳統的腫瘤模型藥物效果檢測方法相比，觀察更加直觀方便，并且可進行活體觀察而不損傷動物，結果更加可靠，具有良好的應用前景。本專利技術的一種可用于評估藥物治療效果的Luc-LLC腫瘤模型，所述腫瘤模型通過采用基因重組技術和慢病毒感染將螢火蟲熒光素酶基因引入人肺腺癌LLC細胞株中，通過亞克隆篩選獲得穩定表達熒光素酶的腫瘤克隆細胞株，然后采用重組的LLC細胞接種于小鼠構建而成。本專利技術的一種可用于評估藥物治療效果的Luc-LLC腫瘤模型的建立方法，包括(I)以前期構建的攜帶有螢火蟲熒光素酶基因的質粒為模板擴增出熒光素酶的cDNA，通過基因克隆的方法插入慢病毒真核表達載體PRRL-CMV質粒中，構建重組質粒 Luc-PRRL-CMV 表達質粒設計螢火蟲熒光素酶基因特異性引物(該引物為上游引物CCTTCTAGAATGGAAGATGCCAAAAACATTAAG;下游引物CCTGTC GACTTACACGGCGATCTTGCCGCCCTTC)；熒光素酶基因的克隆和慢病毒載體的構建使用該特異性引物PCR擴增螢火蟲熒光素酶基因并克隆至PCR-Blunt克隆載體中并轉化大腸桿菌感受態細胞，質粒抽提后運用基因重組方法將熒光素酶目的基因片段插入慢病毒真核表達載體PRRL-CMV空質粒中并轉化大腸桿菌感受態細胞；質粒抽提后進行雙酶切和測序證實構建的表達載體的正確性；(2)慢病毒感染方法將熒光素酶外源基因導入肺癌細胞株的步驟大腸桿菌擴增熒光素酶慢病毒載體和慢病毒包裝質粒，并純化測定濃度；將熒光素酶慢病毒載體的包裝熒光素酶慢病毒表達載體與慢病毒包裝質粒混合后，用轉染試劑共轉染293T細胞，以產生含有螢火蟲熒光素酶慢病毒顆粒的上清，確定慢病毒顆粒的滴度；病毒感染以人肺腺癌LLC為母細胞，用上述病毒上清進行感染；擴增建系進行細胞亞克隆篩選，檢測單克隆細胞內的熒光表達情況，篩選出穩定表達熒光素酶報告基因的重組細胞株并進行擴大培養；(3)腫瘤皮下注射方法將得到的重組人肺腺癌細胞經消化后重懸于氯化鈉溶液中(200 μ 1)，在裸鼠皮下接種(2Χ IO6)該重組人肺腺癌細胞，監測細胞皮下增殖情況，即得到可用于評估藥物治療效果的Luc-LLC腫瘤模型。所述步驟(I)中的基因重組方法為酶切和連接；其中，酶切具體為采用Xba I和 Sal I雙酶切。所述步驟(2)中的熒光素酶慢病毒表達載體與慢病毒包裝質粒的質量比為1:3、 1:6 或 1:9。所述慢病毒包裝質粒包括第三代慢病毒復制所需要的三個基因gag、pol和rev。所述步驟(2)中的轉染試劑為MV40轉染試劑。所述步驟(2)中通過ELISA法確定慢病毒顆粒的滴度；通過細胞有限稀釋法進行細胞亞克隆篩選；通過熒光測定儀或活細胞成像儀檢測單克隆細胞內的熒光表達情況。所述步驟(3)中的氯化鈉溶液質量百分比濃度為O. 9%。所述步驟(3)中通過游標卡尺測量和活體成像儀監測細胞皮下增殖情況。本專利技術的裸鼠模型應用于觀察腫瘤的生長情況和抗腫瘤藥物的治療效果。所選用的動物除了裸鼠，也可以為SCID鼠。有益.效果本專利技術與傳統的腫瘤模型藥物效果檢測方法相比，觀察更加直觀方便，并且可進行活體觀察而不損傷動物，結果更加可靠，具有良好的應用前景。附圖說明圖IA為螢火蟲熒光素酶Luciferase慢病毒載體示意圖IB為質粒酶切鑒定圖2為Luciferase慢病毒載體的包裝；其中，A為目的基因質粒與慢病毒包裝質粒按1:3轉染293T細胞，B為目的基因質粒與慢病毒包裝質粒按1:6轉染293T細胞，C為目的基因質粒與慢病毒包裝質粒按1:9轉染293T細胞；圖3為包裝后的慢病毒上清感染LLC細胞；其中，A為感染后48h ;B為感染后72h ； C為感染后96h ；圖4為穩定表達Luciferase的LLC細胞單克隆篩選；其中,A為Luciferase活性定量分析(RLU)，B為活細胞成像；圖本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種可用于評估藥物治療效果的Luc?LLC腫瘤模型，其特征在于：所述腫瘤模型通過采用基因重組技術和慢病毒感染將螢火蟲熒光素酶基因引入人肺腺癌LLC細胞株中，通過亞克隆篩選獲得穩定表達熒光素酶的腫瘤克隆細胞株，然后采用重組的LLC細胞接種于小鼠構建而成。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：房健民，周爽，楊洋，李棟，
申請(專利權)人：同濟大學蘇州研究院，
類型：發明
國別省市：
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