本發明專利技術涉及一種利用中國石蒜葉片組培快繁的方法，包括以下步驟：(1)以MS培養基為基本培養基，添加6-BA、NAA、2，4-D等植物生長調節劑；(2)采集中國石蒜幼嫩葉片，滅菌；(3)將葉片片段，接種在合適的培養基上；(4)誘導階段為暗培養，繼代培養階段和生根培養給予光照；(5)繼代培養在小鱗莖達到0.5cm高度時進行；(6)生根培養；(7)馴化煉苗，保持濕潤環境，待幼苗葉片伸展，即可進行正常管理。本發明專利技術利用中國石蒜葉片建立快繁體系，具有不破壞母鱗莖、保護珍稀種質的優點；得到的幼苗，具有遺傳基礎一致、性狀穩定、生長勢整齊等特點，在觀賞和藥用新品種繁育與利用中具有顯著的競爭優勢。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種利用中國石蒜的葉片組織建立無菌培養體系快速培養再生植株的方法。2.
技術介紹
中國石蒜Lycoris chinensis 屬石蒜科 Amaryllidaceae 石蒜屬 Lycoris 植物,廣泛分布于東亞地區，在國內主要分布于長江流域以及西南諸省，以其獨特的龍爪形花瓣而著稱，花朵色彩艷麗，花形優美，是一類優良的球根花卉植物和藥用植物。目前，已在華東地區的城市綠化中得到應用，但是，自然條件下，中國石蒜主要依靠鱗莖分球進行繁殖，繁殖系數較低，難以滿足大規模的生產需要。由于快繁技術措施的滯后，園林應用與藥用的采挖已嚴重影響其野生資源的數量，部分地區的野生種群已遭到毀滅性破壞，因此，解決其快繁技術問題已成為中國石蒜野生種群保護與園林生產應用的關鍵。組織培養技術作為植物品種快繁的主要手段已在鱗莖類植物中得到較為廣泛的應用，它可以大幅度提高鱗莖的繁殖系數，滿足中國石蒜快速大規模繁育生產的需要。尤其是利用中國石蒜的葉片作為外植體材料，進行誘導培養，并再生植株的新技術，不但能夠實現中國石蒜的快速商業化生產，還具有不破壞母鱗莖、保護珍稀種質的優點，對于中國石蒜野生種群的保護具有特殊意義。CN102217540A公開了周堅的“一種中國石蒜的快速繁殖方法”專利技術專利技術，以中國石蒜的種胚為外植體，誘導再生植株，這種方法雖然繁殖系數較高，但種子的遺傳背景較復雜，繁育出的后代性狀有分離現象，限制了中國石蒜純系品種的推廣應用。而且以種胚作外植體只能一次性使用，采用葉片作外植體則可以多次采集并保存原鱗莖。3.
技術實現思路
針對現有技術的上述不足，本專利技術要解決的技術問題是利用中國石蒜的葉片組織建立無菌培養體系培養再生植株。解決上述技術問題的技術方案是按如下步驟進行(I)培養基配方和配制適宜外植體幼嫩葉片誘導的培養基配方MS+6-BA 20mg/L+NAA I. Omg/L+蔗糖 30g/L適宜無菌小葉誘導的培養基配方MS+6-BA O. 5mg/L+2,4-D I. Omg/L+鹿糖30g/L繼代培養培養基配方MS+6-BAO. 5mg/L+2，4-D I. Omg/L+ 蔗糖 30g/L 生根培養培養基配方1/2MS+NAA O. 5mg/L+蔗糖30g/L具體的配制方法A、按照MS培養基配方，把大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物、植物激素分類，每一類中各種藥品分別稱量，可按照一定倍數配制濃縮液，然后按照順序量取所需體積混合在一起，最后加蒸懼水，定容至I升；B、然后加入蔗糖、瓊脂，調節ph值至5. 9，微波爐加熱，煮沸至溶液中瓊脂完全溶解呈透明為止；C、將配制好的培養基分裝在事先準備好的培養瓶中，IL 一般可分裝成20-22瓶， 然后蓋上蓋子并注明標簽。最后將用牛皮紙包好的培養皿、濾紙以及蒸餾水一道進行高壓滅菌，滅菌溫度為121 °C，維持時間18-25min ；D、滅菌過的培養基通常放在接種室或培養室中保存，放置24小時后使用，一般應在滅囷后的兩周內用完。(2)葉片采集和處理A :采集中國石蒜幼嫩葉段，采樣袋密封帶回實驗室，清水仔細沖洗，去除葉片表面污物，然后移至接種室；B :選取中國石蒜無菌苗剛長出的嫩葉，在超凈工作臺上截成Icm左右的片斷，直接接種；(3)滅菌和接種將清洗干凈的葉段在超凈工作臺上按下列順序進行滅菌75%乙醇中消毒 30-60s—無菌水清洗2次一O. 1% HgC12溶液中滅菌8-10min—無菌水清洗4次一無菌濾紙吸干表面水分；然后用解剖刀將葉段切成O. 8-1. Ocm的片段，接種在培養基上，以上操作過程在酒精燈火焰30cm范圍內進行；(4)培養條件將接種葉片片段的培養瓶整齊擺放在培養架上，誘導階段為暗培養，溫度 25±2°C ；繼代培養階段和生根培養階段在光照條件下培養，光照強度1000-12001χ，光照時間16小時，溫度25±2°C ；(5)繼代培養待葉片組織分化出的白色小鱗莖達到O. 5cm高度時，進行繼代培養，選用繼代培養培養基，轉接操作在超凈工作臺上進行，將小鱗莖上半部切除后，轉接于新的培養基上， 繼代培養可連續培養多代，以實現快速增殖；(6)生根培養繼代培養得到的小鱗莖達到O. 5cm以上時，即可進行生根培養，將生長勢健壯的中國石蒜小苗轉接于生根培養基上，待長出3條以上的白色根須后，進行馴化；(7)馴化移栽A、馴化煉苗分兩步進行，第一步，每天將培養瓶的蓋子揭開一段時間，使幼苗接觸外界空氣，并逐漸延長時間，大約一周后完全揭開瓶蓋；B、第二步，將幼苗取出，用清水清洗，除去附著的培養基，然后修剪較長的根須，移栽于基質中，基質由泥炭珍珠巖蛭石按I : I : I配制，保持基質濕潤，空氣濕度在 90%以上，并加蓋遮陽網；C、兩周后，待幼苗葉片伸展，即可除去遮陽網，進行正常栽培管理。本專利技術的有益效果是(1)利用中國石蒜葉片作為外植體材料，建立無菌快繁體系，進行誘導培養和繼代培養，并再生植株，實現中國石蒜的快速繁育。(2)由無菌組織培養CN 102972289 A說明書3/3 頁得到的中國石蒜幼苗，具有遺傳基礎一致、性狀穩定、生長勢整齊等特點，在觀賞和藥用新品種栽培中具有顯著的競爭優勢。4.附圖說明圖1 :無菌小葉誘導出小鱗莖(第I個月)；圖2 :葉片誘導小鱗莖(第2個月)； 圖3 :葉片誘導的愈傷組織進行小鱗莖誘導(第3個月)；圖4 :小鱗莖增殖(第4個月)； 圖5:小鱗莖增殖(第5個月)。5.具體實施方式下面結合實施例作進一步詳述本專利技術所指明的培養過程包括三個培養階段，各培養階段所用培養基配方均以MS培養基為基礎，添加不同種類和不同濃度的植物生長調節劑構成。通過不同種類和不同濃度的植物生長調節劑的調節，調控中國石蒜葉片再生植株的發育過程，實現中國石蒜葉片的脫分化、再分化，得到再生植株。下面將不同培養階段的中國石蒜培養物按四項實施例列于下表權利要求1.，其技術方案按如下步驟進行 (1)培養基配方和配制 適宜外植體幼嫩葉片誘導的培養基配方MS+6-BA 20mg/L+NAA I. Omg/L+蔗糖30g/L 適宜無菌小葉誘導的培養基配方MS+6-BA O. 5mg/L+2，4-D I. Omg/L+蔗糖30g/L 繼代培養培養基配方MS+6-BA O. 5mg/L+2，4-D I. Omg/L+ 蔗糖 30g/L 生根培養培養基配方1/2MS+NAA O. 5mg/L+蔗糖30g/L 具體的配制方法 A、按照MS培養基配方，把大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物、植物激素分類，每一類中各種藥品分別稱量，可按照一定倍數配制濃縮液，然后按照順序量取所需體積混合在一起，最后加蒸懼水，定容至I升； B、然后加入蔗糖、瓊脂，調節ph值至5.9，微波爐加熱，煮沸至溶液中瓊脂完全溶解呈透明為止； C、將配制好的培養基分裝在事先準備好的培養瓶中，IL一般可分裝成20-22瓶，然后蓋上蓋子并注明標簽。最后將用牛皮紙包好的培養皿、濾紙以及蒸餾水一道進行高壓滅菌，滅菌溫度為121 °C，維持時間18-25min ； D、滅菌過的培養基通常放在接種室或培養室中保存，放置24小時后使用，一般應在滅囷后的兩周內用完。(2)葉片采集和處理 A :采集中國石蒜幼嫩葉段，采樣袋密封帶回實本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種利用中國石蒜葉片組培快繁的方法，其技術方案按如下步驟進行：(1)培養基配方和配制適宜外植體幼嫩葉片誘導的培養基配方：MS+6?BA?20mg/L+NAA?1.0mg/L+蔗糖30g/L適宜無菌小葉誘導的培養基配方：MS+6?BA?0.5mg/L+2，4?D?1.0mg/L+蔗糖30g/L繼代培養培養基配方：MS+6?BA?0.5mg/L+2，4?D?1.0mg/L+蔗糖30g/L生根培養培養基配方：1/2MS+NAA?0.5mg/L+蔗糖30g/L具體的配制方法：A、按照MS培養基配方，把大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物、植物激素分類，每一類中各種藥品分別稱量，可按照一定倍數配制濃縮液，然后按照順序量取所需體積混合在一起，最后加蒸餾水，定容至1升；B、然后加入蔗糖、瓊脂，調節ph值至5.9，微波爐加熱，煮沸至溶液中瓊脂完全溶解呈透明為止；C、將配制好的培養基分裝在事先準備好的培養瓶中，1L一般可分裝成20?22瓶，然后蓋上蓋子并注明標簽。最后將用牛皮紙包好的培養皿、濾紙以及蒸餾水一道進行高壓滅菌，滅菌溫度為121℃，維持時間18?25min；D、滅菌過的培養基通常放在接種室或培養室中保存，放置24小時后使用，一般應在滅菌后的兩周內用完。(2)葉片采集和處理A：采集中國石蒜幼嫩葉段，采樣袋密封帶回實驗室，清水仔細沖洗，去除葉片表面污物，然后移至接種室；B：選取中國石蒜無菌苗剛長出的嫩葉，在超凈工作臺上截成1cm左右的片斷，直接接種；(3)滅菌和接種將清洗干凈的葉段在超凈工作臺上按下列順序進行滅菌：75％乙醇中消毒30?60s→無菌水清洗2次→0.1％?HgCl2溶液中滅菌8?10min→無菌水清洗4次→無菌濾紙吸干表面水分；然后用解剖刀將葉段切成0.8?1.0cm的片段，接種在培養基上，以上操作過程在酒精燈火焰30cm范圍內進行；(4)培養條件將接種葉片片段的培養瓶整齊擺放在培養架上，誘導階段為暗培養，溫度25±2℃；繼代培養階段和生根培養階段在光照條件下培養，光照強度1000?1200lx，光照時間16小時，溫度25±2℃；(5)繼代培養待葉片組織分化出的白色小鱗莖達到0.5cm高度時，進行繼代培養，選用繼代培養培養基，轉接操作在超凈工作臺上進行，將小鱗莖上半部切除后，轉接于新的培養基上，繼代培養可連續培養多代，以實現快速增殖；(6)生根培養繼代培養得到的小鱗莖達到0.5cm以上時，即可進行生根培養，將生長勢健壯的中國石蒜小苗轉接于生根培養基上，待長出3條以上的白色根須后，進行馴化；(7)馴化移栽A、馴化煉苗分兩步進行，第一步，每天將培養瓶的蓋子揭開一段時間，使幼苗接觸外界空氣，并逐漸延長時間，大約一周后完全揭開瓶蓋；B、第二步，將幼苗取出，用清水清洗，除去附著的培養基，然后修剪較長的根須，移栽于基質中，基質由泥炭∶珍珠巖∶蛭石按1∶1∶1配制，保持基質濕潤，空氣濕度在90％以上，并加蓋遮陽網；C、兩周后，待幼苗葉片伸展，即可除去遮陽網，進行正常栽培管理。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：姜小鳳，童再康，時劍，高燕會，
申請(專利權)人：浙江農林大學，
類型：發明
國別省市：
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