一種替考拉寧的純化方法技術

本發明專利技術提供一種替考拉寧的純化方法，該純化方法包括如下步驟：(1)調節替考拉寧發酵液至堿性后進行過濾；(2)將步驟(1)得到的濾液調節至酸性后通過大孔吸附樹脂，依次用水、氨水洗脫，收集氨水洗脫液；(3)將步驟(2)得到的洗脫液過濾，濾液通過硅膠層析分離，收集體積比為10-50％乙醇水溶液的洗脫液；(4)將步驟(3)得到的洗脫液調節至酸性后通過截流分子量為5000～30000Da，優選為10000Da的超濾膜進行超濾，得到超濾液；以及(5)將步驟(4)得到的超濾液通過截流分子量為100～1000Da，優選為200Da的納濾膜進行納濾，濃縮得到替考拉寧。本發明專利技術的純化方法最大限度地提高了替考拉寧的生產效率從而實現了高純度替考拉寧的產業化生產。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及。
技術介紹
替考拉寧(teicoplanin)是比較有代表性的糖肽系列抗生素。臨床上主要用于治療金葡菌及鏈球菌屬等敏感菌所致的嚴重感染，如心內膜炎、骨髓炎、敗血癥及呼吸道、泌尿道、皮膚、軟組織等的感染。其抗菌機理在于該物質可以阻礙革蘭氏陽性菌株細胞壁合成過程中肽聚糖合成中間體的相互結合，從而起到抑制上述細菌成長的作用。在現有的替考拉寧生產方法中，一般采用替考游動放線菌作為替考拉寧的生產菌株，并需要對發酵獲得的替考拉寧粗品進行純化。中國專利申請200710107185. 6公開了一種高純度替考拉寧的生產方法，該方法具體如下對替考拉寧粗品溶解于碳酸鈉和碳酸氫鈉的緩沖液，后采用GE公司的葡聚糖凝膠或瓊脂糖類凝膠進行層析。層析液調pH7. 0后通過大孔吸附樹脂JD-I再次進行分離，用60%乙醇洗脫；分離液進行炭脫、超濾、納濾得到納濾濃縮液，濃縮液加入丙酮，至丙酮濃度為68%，過濾除去析出的雜質，再加入丙酮，至90%丙酮濃度，析出替考拉寧，過濾干燥后得到替考拉寧成品。該方法的缺陷在于工藝復雜，分離純化效果差，提煉收率低，實際操作難度大；采用進口葡聚糖凝膠和瓊脂糖類凝膠進行層析，價格昂貴，設備投入高；結晶時使用大量丙酮，影響生產環境和人員健康。因此，迫切需要開發出新的能夠適用于產業化生產的替考拉寧提純方法。
技術實現思路
為了克服現有技術的缺陷，本專利技術提供了，該純化方法包括如下步驟(I)調節替考拉寧發酵液至堿性后進行過濾；(2)將步驟(I)得到的濾液調節至酸性后通過大孔吸附樹脂，依次用水、氨水洗脫，收集氨水洗脫液； (3)將步驟⑵得到的洗脫液過濾，濾液通過硅膠層析分離，收集10-50% (體積比)乙醇水溶液的洗脫液；(4)將步驟(3)得到的洗脫液調節至酸性后通過截流分子量為5000 30000Da，優選為IOOOODa的超濾膜進行超濾，得到超濾液；(5)將步驟(4)得到的超濾液加入環氧乙烷，升溫到30_50°C，優選為40°C，攪拌，然后通過截流分子量為100 lOOODa，優選為200Da的納濾膜進行納濾，濃縮得到替考拉寧。優選地，在步驟(I)中，所述堿性是指pH為9-11 ;更優選地，所述過濾為陶瓷膜過濾。優選地，在步驟(2)中，所述酸性是指pH為6. 5-7. 5。優選地，在步驟(2)中，所述大孔吸附樹脂選自D101、DA201、JD-l、FX-06、FX-03，優選大孔吸附樹脂FX-06。優選地，在步驟(3)中，所述洗脫液先進行如下處理，然后再過濾向所述洗脫液中加入30%的丙酮，在80攝氏度下反應2個小時，倒入冰水中，鹽析出白色沉淀物，然后過濾掉沉淀物。優選地，在步驟(3)中，所述洗脫液經活性碳脫色后再過濾；更優選地，所述活性炭脫色的溫度為15-20°C。優選地，在步驟(3)中，通過所述硅膠層析分離的濾液的pH為6. 5-7. 5。優選地，在步驟(4)中，所述酸性是指pH為6. 5-7.5 ;更優選地，所述超濾溫度為10-15。。。 優選地，在步驟(5)中，升溫后的超濾液經藥用炭脫色，然后再進行納濾。優選地，在步驟(5)中，所述納濾溫度為10_15°C。優選地，所述純化方法還包括將得到的替考拉寧在-40 _50°C下凍干的步驟。本專利技術的純化方法最大限度地提高了替考拉寧的生產效率，從而實現了高純度替考拉寧的產業化生產。與現有技術相比，本專利技術的方法至少具備以下有益效果本專利技術用新的大孔吸附樹脂，例如FX06與硅膠層析代替了現有技術中的DJ-I大孔樹脂或Q sepharose凝膠，并用凍干方法代替了原有專利中丙酮結晶的方法。減少了有機溶劑的使用，這不僅僅保護了環境，更避開了有機溶劑殘留這個問題。并且通過本專利技術純化方法得到的替考拉寧有效成分得到了提高，外觀顏色得到明顯改觀，并且提純的成本得到有效降低。具體實施例方式以下參照具體的實施例來說明本專利技術。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅用于說明本專利技術，其不以任何方式限制本專利技術的范圍。實施例I(I)將100L替考拉寧發酵液用4%氫氧化鈉調整pH為9 11，進行含量測定，含量為1257mg/L，經50nm的陶瓷膜過濾，過濾溫度小于25°C，頂水量為300L，最終得到陶瓷膜過濾液為376L，進行測定含量為330mg/L，回收替考拉寧124. 08g,收率為98. 71 %。(2)將步驟⑴中得到的陶瓷膜過濾液，用5%鹽酸調整pH為6. 5 7. 5，通過大孔吸附樹脂FX-06吸附，用水頂洗樹脂至流出的水無色后，用0. Imol的氨水進行解析，流速為2BV/hr，得到解析液21. 5L ;調整pH為5. 0 6. 0，進行測定含量為4963mg/L，回收替考拉寧106. Ig,收率為85. 99%。解析液經HPLC分析，替考拉寧A2的峰面積為總峰面積的89. 1%。(3)向步驟⑵中解析液21. 5L，加入30體積％的丙酮，在80攝氏度下反應2個小時，倒入冰水中，鹽析出白色沉淀物，然后過濾掉沉淀物，得到剩余解析液，加入針用炭106g，控制溫度為15 20°C，攪拌30 50min，過濾后得澄清濾液。濾液回調pH為6. 5 7.5，上硅膠層析分離，用8. OL 10%乙醇洗滌，流速lBV/hr ;用4.0L 20%乙醇洗滌，流速lBV/hr，最后用50%乙醇溶液以0. 5BV/hr的流速洗脫，按先后順序收集洗脫液，洗脫液混合后得到6. 5L溶液，測定含量為10500mg/L，回收替考拉寧68. 25g，收率為71. 07 % ;洗脫液經HPLC分析，替考拉寧A2的峰面積為總峰面積的93. 6%。(4)將步驟(3)洗脫液調整pH為6. 5 7. 5，然后經過截流分子量為IOOOODa的超濾膜去除大分子雜質，超濾時溫度控制在10 15°C，用注射用水進行頂洗，頂洗量為13L，得到超濾液18. 66L ；(5)在萬級潔凈區，將步驟⑷得到的超濾液加入環氧乙烷，升溫到40°C，攪拌，力口入藥用炭，攪拌，趁熱過濾除炭，再用分子截流量為200Da的納濾膜濃縮至0. 6L，溫度控制在10 15°C，邊濃縮邊用注射用水進行頂洗，頂洗量為2. 4L，最后得濃縮液0. 56L，測定含量為100500mg/L，回收替考拉寧56. 28g，收率為88. 35% ;經解析液經HPLC分析，替考拉寧A2的峰面積為總峰面積的93. 8%，純度為95. 2%(6)將步驟(5)濃縮液經0. 22 pm過濾器過濾后，進行凍干，預凍溫度為-40 -50度，預凍時間3小時，升華時間12小時，升華溫度到45°C，高溫保溫I小時，得替考拉寧成品 55. 7g，水分為3. 1%，經HPLC分析，替考拉寧純度為95. 2%。權利要求1.，該純化方法包括如下步驟 (1)調節替考拉寧發酵液至堿性后進行過濾； (2)將步驟(I)得到的濾液調節至酸性后通過大孔吸附樹脂，依次用水、氨水洗脫，收集氨水洗脫液； (3)將步驟(2)得到的洗脫液過濾，濾液通過硅膠層析分離，收集體積比為10-50%乙醇水溶液的洗脫液； (4)將步驟(3)得到的洗脫液調節至酸性后通過截流分子量為5000 30000Da，優選為IOOOODa的超濾膜進行超濾，得到超濾液；以及 (5)將步驟⑷得到的超濾液加入環氧乙燒，升溫到30-50°C本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種替考拉寧的純化方法，該純化方法包括如下步驟：(1)調節替考拉寧發酵液至堿性后進行過濾；(2)將步驟(1)得到的濾液調節至酸性后通過大孔吸附樹脂，依次用水、氨水洗脫，收集氨水洗脫液；(3)將步驟(2)得到的洗脫液過濾，濾液通過硅膠層析分離，收集體積比為10？50％乙醇水溶液的洗脫液；(4)將步驟(3)得到的洗脫液調節至酸性后通過截流分子量為5000～30000Da，優選為10000Da的超濾膜進行超濾，得到超濾液；以及(5)將步驟(4)得到的超濾液加入環氧乙烷，升溫到30？50℃，優選為40℃，攪拌，然后通過截流分子量為100～1000Da，優選為200Da的納濾膜進行納濾，濃縮得到替考拉寧。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：黃志強，陳青，黃娟，劉文峰，趙正國，賴慶云，
申請(專利權)人：麗珠集團福州福興醫藥有限公司，
類型：發明
國別省市：