電化學檢測結合反應的方法技術

本發明專利技術涉及一種在溶液中用高度靈敏的電化學檢測進行均相免疫測定形式的方法，其特征在于將作為試劑的兩種不同的結合物與樣品或樣品/緩沖液混合物組合，其中一種結合物包含氧化還原標志物和分析物分子，而另一種結合物包含抗氧化還原標志物抗體或其特異性結合片段以及特異性結合所述分析物的分子。所述方法適用于診斷中不含洗滌且不含分離的免疫測定，特別適用于自動化及微流體免疫測定。所述方法還適用于廉價的免疫測定系統和一次性測試條。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】本專利技術涉及一種直接且高靈敏度的電化學檢測溶液中的抗體-抗原結合反應和其他生物化學相互作用的方法。所述方法適用于診斷中不含洗滌且不含分離的免疫測定，特別適用于自動化及微流體免疫測定。所述方法還適用于廉價的免疫測定系統和一次性使用的測試條。免疫測定使用抗原-抗體反應以特異性檢測復雜介質如血液、血清、尿或食品中最小濃度的分析物。幾十年來，免疫測定已成為臨床診斷、環境分析和食品分析中不可缺少的工具，用于檢測最小濃度的激素、代謝物、蛋白質、生物標記、毒素、殺蟲劑、病原菌和病毒。許多最重要的臨床-診斷分析物僅用免疫測定可廉價且快速地測量，因為沒有提供高靈敏度(檢測納摩爾或更低濃度)和高特異性(在具有化學相似結構的干擾物質的存在下檢測分析物)的相當組合的備選分析化學方法。備選方法如色譜法(例如HPLC、氣相色譜法)常需要多步樣品制備，例如通過提取和化學衍生化進行制備。 自50年前Rosalyn Yalow和Salomon Berson專利技術免疫測定以來，已開發了許多不同的實施方案，被稱為不同的免疫測定形式(format)。異相形式如ELISA(酶聯免疫吸附測定)與均相形式之間的根本區別建立在用于檢測的抗體的聚集狀態的基礎上在異相測定中，將抗體(較少見的是抗原)固定在表面(反應管、微量滴定板、測試條)上；所有反應步驟(如洗滌和分離步驟，如檢測)同樣在該表面上進行。在均相形式中，不將任何結合配偶體(binding partner)固定，無需洗滌和分離步驟，并且檢測同樣在溶液中進行。區分的另一可能性來自使用的檢測方法。因為不可能使得抗體-抗原結合反應直接可見，所以結合配偶體之一必須與分子標志物(marker)或“標記(label) ”化學偶聯(例外基于表面等離子體共振的質量敏感型生物傳感器、光柵耦合器、石英晶體微天平、表面聲波以及實時直接測量分子結合反應的相似技術(如果結合配偶體之一固定在敏感表面上)。然而，這些方法迄今僅用于研究應用而不是常規分析中)。合適的標記必須具有高“比活度”，即每個標記分子必須產生盡可能多的信號傳導事件。最常用的標記包括放射性同位素(放射免疫測定，“RIA”)、熒光染料(熒光素、羅丹明等)、熒光半導體納米顆粒(“量子點”)、聚合物納米顆粒(“膠乳珠”，團聚免疫測定)以及酶如過氧化物酶，連同比色、熒光或化學發光酶底物(ELISA)。放射性同位素具有最高的比活度，甚至允許檢測單個標記分子。由于來自放射性的健康危害，相關的高實驗室要求(“同位素實驗室”)和高成本的殘余物處置，因此放射性免疫測定逐漸被備選方法如ELISA代替。不同免疫測定之間的另一區別由使用的抗體類型所致?？贵w為具有復雜結構的蛋白質，其具有決定結構并在所有抗體類別中具有相似組成的恒定區以及形成抗原結合位點的高度可變區。最初使用的包含多種具有可變的特異性和親和力的抗體的多克隆血清在許多應用中被單克隆抗體代替，所述單克隆抗體確切地僅包含一種具有明確定義的特異性和親和力的抗體實體(“克隆”)。理論上，可以制備任意量的具有相同性質的單克隆抗體。此夕卜，可以通過酶消化從完整抗體制備的所謂的抗體片段也用于一些分析。單鏈抗體是可以通過遺傳工程方法制備的重組抗體片段。原則上，所有類型的抗體以及由其衍生的分子結合劑(molecular binder)均可以用于已知的免疫測定形式中。公知的可以用免疫測定檢測的臨床分析物包括hCG (妊娠試驗)、甲狀腺激素如TSH(甲狀腺病)、類固醇激素(內分泌學、能育性)和PSA(前列腺癌的生物標記)。總體而言，可以說基于單克隆抗體或多克隆抗血清的免疫測定是生物技術、臨床診斷、環境分析和食品分析的最重要的分析化學方法，并且具有高商業價值。現有技術記載了多種進行免疫測定的方法。大多數異相免疫測定需要幾個人工過程，例如移液步驟、樣品稀釋、洗滌步驟，它們必須按照確切的時間方案。因此，通常需要為這些過程特別配備的專門人才和實驗室以正確進行這樣的測定。需要的檢測裝置(“酶標儀”、微量滴定板讀數器、免疫測定分析儀)昂貴且不便于攜帶。例如，進行ELISA測試的方案描述于專利中。本領域技術人員容易地認識到這樣復雜的分析方法僅可以由專門人才進行，并且僅可以在合適的實驗室環境中進行。這樣的方法的自動化是非常艱巨的，并且需要高度復雜的自動機。 對于現場(on-site)使用，已接受異相橫向流動免疫測定形式(“測試條”免疫測定)。US6156271A記載了這種測定形式的現代變體。這種測試在加入樣品溶液后自動運行，并且在完全可視的基礎上進行檢測(由使用者讀出測試條上一條或兩條有色條帶的存在)。很明顯這樣的讀數方法不能產生定量結果(即濃度的精確測量)，而僅可能是是/否陳述或半定量陳述(濃度低于/高于某一閾值)。本領域技術人員已知相比之下,均相免疫測定(homogeneousimmunoassay)特別適合于實現快速、定量及全自動免疫測定。在均相免疫測定中，信號產生與結合反應同時進行。不同于上述異相免疫測定，均相免疫測定主要由僅一個或幾個配料(dosing)操作、溫育時間和檢測步驟組成。在理想情況下，在可以測量最終值之前僅需要混合樣品與預制的(ready-made)試劑混合物(所謂的“混合和測量”測試)。在I: I混合物即相同體積份的樣品和試劑混合物的情況下，可用具有高精度的最簡單的方法進行配料。本領域技術人員可以容易地認識到均相免疫測定還允許最短的可能的分析持續時間，因為在實現抗體與抗原之間的結合平衡之后立即測量是可能的。均相免疫測定的缺點是需要較高的化學合成支出以將結合反應與信號產生相關聯。在專利US4960693A中，記載了抗體-酶片段I結合物的合成，從而功能酶(“全酶”)僅在抗原-酶片段2結合物的結合之后形成。這樣的結合物的化學合成是在空間上是困難的，并且不同樣適合所有類型的分析物。此外，由于與酶反應關聯需要額外的反應時間，因此這種原理不被接受。用于低分子分析物的更普遍且化學上更簡單的方法是熒光偏振免疫測定，例如EP0200960A所述。在這種方法中，合成分析物(此處是雌三醇)與熒光染料(在大多數情況下為熒光素)的結合物。用線偏振激發光照射測量的溶液。只要該結合物在溶液中是游離的，則發出的熒光不是偏振的(消偏振的)。僅在結合至抗體之后，結合物的旋轉速度受限至這樣的程度，以致發出的熒光也是偏振的。通過這樣，可以實時測量結合平衡。這種方法的缺點是用于檢測的設備的高支出，因為檢測需要偏振單色光源和兩個裝備有偏振濾光片的熒光檢測器。因此，這種原理僅在特殊實驗室應用中被接受，但是在常規診斷和現場使用中則不被接受。此外，其僅適用于低分子分析物。對蛋白質分析物需要其他方法。Sellrie等人的方法中實現了技術上更容易的低分子分析物的檢測，其利用銪穴狀化合物免疫測定(abbr. :EuCr)作為實例。在這種情況下，合成EuCr-熒光素結合物，其中在EuCr和熒光素之間可存在盡可能短的接頭，所述接頭由I個至不超過3個亞甲基組成。除了抗EuCr抗體外，另外采用抗熒光素抗體，其在結合至熒光素后猝滅后者的熒光。信號產生原理是基于這樣的事實，為了空間原因，兩種抗體中僅一種可以結合至所述結合物。結合平衡和因此的熒光強度取決于游離EuCr的濃度，并且可以直接實本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：J·埃特林格，N·加約維奇艾歇爾曼，B·米歇爾，G·沙爾特，J·申克，
申請(專利權)人：弗勞恩霍弗應用技術研究院，
類型：
國別省市：