香精香料中四種禁用成分含量的測定方法技術

一種香精香料中四種禁用成分（馬兜鈴酸、水楊酸、正二氫愈創酸和鄰氨基苯甲酸肉桂酯）含量的測定方法，包括樣品溶液的制備，液相色譜分析及測定結果的計算等步驟。本發明專利技術的檢測方法經優化之后具有檢測時間短、操作簡便、靈敏度高、回收率高及重復性好等優點，本發明專利技術方法的色譜條件使馬兜鈴酸、水楊酸、正二氫愈創酸和鄰氨基苯甲酸肉桂酯色譜峰與雜質色譜峰分離較好，并且具有較好的相關性，檢測限在0.04~0.34μg/g之間，平均回收率分別為94.01％、95.96％、86.48%和84.28％，樣品測試結果的平均相對標準偏差分別為4.40%、2.39％、2.49%和3.35％。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于香精香料的理化檢驗
，具體涉及香精香料中四種禁用成分馬兜鈴酸、水楊酸、正二氫愈創酸和鄰氨基苯甲酸肉桂酯含量的測定方法，
技術介紹
馬兜鈴酸是碳環芳香族酸性化合物，基本骨架構成為蒽菲型結構，主要存在于馬兜鈴科植物中。早期發現該類物質具有抗腫瘤活性、抗感染及增強吞噬細胞活性等作用。隨著研究的深入，馬兜鈴酸類物質已被證實具有腎毒、致癌和致基因突變作用。馬兜鈴酸與腎病討論由來已久，1964年我國吳松寒首次報道了兩例病人因服用大劑量木通(含馬兜鈴酸)導致急性腎功能衰竭，此后陸續有相關的報道，但未引起廣泛關注。1993年，比利·時學者Vanherweghem等首先發現2例女性服中草藥減肥治療后，出現慢性腎損害，病理組織學證實為快速進展的腎間質纖維化，經薄層色譜儀分析發現減肥膠囊中含馬兜鈴酸(aristolochic acid, AAs)。至1998年歐洲已有100余人因服該減肥藥導致慢性腎損害，其中1/3已接受腎移植；1999年英國報道了兩例因攝入木通而導致的晚期腎衰竭病例。由于有了這些病例，國內外才提出禁止馬兜鈴酸在藥品和食品中使用的相關政策。從1999年7月29日，英國宣布禁止銷售和使用含馬兜鈴酸的中藥。2000年6月9日，美國藥品與食品管理局(FDA)在至今未收到類似不利事件報告的情況下，命令停止進口、制造和銷售已知含有和懷疑含有馬兜鈴酸的原料和成品，導致多達70余種中藥被列入黑名單。2000年11月，世界衛生組織(World Health Organization,簡稱WHO)在其藥物通訊中發出類似警告，西班牙、奧地利、埃及、馬來西亞、菲律賓、日本等國紛紛效仿。2003年4月，我國國家食品藥品監督管理局(State Food and Drug Administration,簡寫為SDA)取消了木通的藥用標準。2004年8月又取消了廣防己、青木香的藥用標準，并對含馬兜鈴、尋骨風、天仙藤和朱砂蓮的中藥制劑嚴格按處方藥管理。水楊酸是一種植物激素，對植物生長發育過程及植物抗藥性方面有調控作用，可以延緩多種果實成熟衰老進程。而且水楊酸具有一定的抑菌作用，在醫藥化工中用于消毒和治療各種慢性皮膚病。另外，水楊酸還具有去角質、促進皮膚代謝的功效，在化妝品行業中也廣泛使用。但是水楊酸在人體內會氧化為草酸，引起中毒，被列為食品禁用防腐劑。而且水楊酸對皮膚具有刺激性，嚴重可導致皮炎。對眼睛刺激性大，其半數致死量LD50 (大鼠，口服)為891 mg/kg ；LD50 (肌肉，靜脈注射)為500 mg/kg。美國食品藥品管理局、美國皮膚病學會認為水楊酸的外用安全濃度是0.5-2. O %。中國食品藥品管理局也規定了護膚品中水楊酸的上限為2 %。正二氫愈瘡酸具有多種生物活性，包括抑制脂氧化酶、乳頭狀瘤病毒、單純皰疹病毒、HIV及降血糖作用、人腦惡性膠質瘤的治療作用。Larreatridentate Coville灌木的葉子、莖被制作成膠囊，發現早期被應用到膳食中。然而，在飲用了含有正二氫愈瘡酸的茶葉或是食用了含有5 - 10%干重的正二氫愈瘡酸膠囊后，出現了非感染性肝炎的病例，同時研究報告結論表明過量攝入正二氫愈瘡酸會導致腎損傷。通過機理方面的研究表明，正二氫愈瘡酸作為抗氧化劑，其具有治療優勢。但是其他一些報告也顯示出正二氫愈瘡酸作為抗氧化劑具有潛在的毒性、致癌性和致突變性。在最近的一些研究發現在低劑量的測試中，正二氫愈瘡酸對DNA的合成有優先的抑制作用；在高劑量的測試中，對蛋白質的合成有明顯的抑制作用。 鄰氨基苯甲酸肉桂酯具香脂膏香、水果香氣，帶棕褐色粉末。略帶棕色粉狀體。有似葡萄糖的果香和膏香。熔點大于60°C;d I. 18(15. 5°C );沸點332°C /IO50在60多年前此化合物已用于食品和日化用品的加香，此化合物已經被認證對公眾健康無害的人造香味料。但是鄰氨基苯甲酸肉桂酯可燃，燃燒可形成有毒的氮氧化合物。關于馬兜鈴酸的檢測，早期方法出現于1975年，Rao. K. V等人采用熒光分光光度計和氣液色譜建立了馬兜鈴酸檢測方法。1988年中華人民共和國藥典中，測定馬兜鈴酸的方法為薄層色譜方法；1989年開始，多種針對不同來源樣品的高效液相色譜(HPLC)測定馬兜鈴酸方法被建立；2002年，Kite，G.C.等人采用液相色譜二級質譜(LC-MS/MS)的方法建立了馬兜鈴酸檢測方法，并采用該方法開展了定性和定量工作。此外，在早期測定馬兜鈴酸的方法還出現了分光光度法、極譜法，由于分光光度法和極譜法存在專屬性較差、檢測限較高等原因，目前這兩種檢測方法應用較少。正二氫愈瘡酸的主流分析方法包括高效液相色譜質譜檢測器方法(HPLC-MS/MS)、高效液相色譜紫外檢測器方法(HPLC-DAD)、微池毛細管電泳色譜安培檢測器方法和高效液相色譜熒光檢測器方法(HPLC-FLD)等，這些方法的共性即是用高效液相色譜或毛細管色譜進行分離，采用質譜、紫外或熒光檢測器進行檢測。水楊酸的檢測方法有五種類型，它們包括液相色譜法、分光光度法、流動注射分析法、離子色譜法、化學發光法等。測定水楊酸的分析方法中較為經典的方法是上世紀七十年代AOAC根據水楊酸和鐵離子(Fe3+)生成紫堇色的絡合物，并采用分光光度法測定有色絡合物的分析方法，該方法是適用于食品中水楊酸測定。美國藥典32版(USP32)中，建立了水楊酸的液相色譜測定方法，該方法采用液相分離，紫外檢測器采集270 nm紫外波長的方法檢測了藥品中的水楊酸。田蘭等考察了不同PH值條件下流動相對峰分離度和峰形的影響，發現當PH值為3時，分離效果最好。李效寬等對多種流動相體系進行了比較，發現采用甲醇/0. 02 mol/L磷酸二氫鉀溶液(體積比，40:60)(磷酸調pH至3. O)為流動相時，分離效果最好。隨著現代分析儀器技術的發展，出現了 LC-MS測定水楊酸的分析方法。2005年SiskaC等利用LC-MS對動物組織中的水楊酸和代謝物進行定量測定Jiri G等用UPLC-MS/MS檢測飲料中包括水楊酸在內的17種酚酸，分析時間在12 min以內，大大提高了分析效率和分析結果的準確性。同時，由于液質聯用高靈敏度特點，因此液質聯用方法也是目前測定水楊酸靈敏度較高的檢測方法。目前關于鄰氨基苯甲酸肉桂酯的測定方法國內外研究極少。Demers等人曾用高效液相色譜熒光檢測法測定了香水及花露水中的鄰氨基苯甲酸肉桂酯，Sherma等做過類似的研究，二者的測定結果均較為理想；Keyhanfar等同樣用高效液相色譜熒光檢測法測定了小鼠體內的鄰氨基苯甲酸肉桂酯及其代謝物，測定結果符合定量分析的要求。目前，國內外公開文獻暫無關于這四種禁用成分的同時檢測方法。
技術實現思路
本專利技術的目的正是基于上述狀況，通過長期的研究和探索，在方法對比、優化的基礎上，提出了一種香精香料中四種禁用成分(馬兜鈴酸、水楊酸、正二氫愈創酸和鄰氨基苯甲酸肉桂酯)含量的測定方法，用于檢測香精香料中馬兜鈴酸、水楊酸、正二氫愈創酸和鄰氨基苯甲酸肉桂酯的含量。本專利技術考察研究了香精香料中馬兜鈴酸、水楊酸、正二氫愈創酸和鄰氨基苯甲酸肉桂酯的萃取條件，優化了色譜分離的條件，為簡便、快速有效的測定香精香料中上述四種禁用成分殘留的含量提供了技本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種香精香料中四種禁用成分馬兜鈴酸、水楊酸、正二氫愈創酸和鄰氨基苯甲酸肉桂酯含量的同時測定方法，其特征在于：包括以下步驟：（1）萃取溶液的配制：稱取1g的抗壞血酸加入到1L的容量瓶中，用0.1%的甲酸甲醇?水的混合溶液定容，甲醇與水的體積比為9:1；（2）標準溶液的配制：用萃取溶液分別配制具有濃度梯度的馬兜鈴酸、水楊酸、正二氫愈創酸和鄰氨基苯甲酸肉桂酯的標準工作溶液；（3）樣品溶液的制備：使用萃取溶液振蕩萃取樣品，然后離心過濾制備樣品溶液；（4）液相色譜分析：利用液相色譜儀分別對標準溶液和樣品溶液進行檢測分析；（5）香精香料中馬兜鈴酸、水楊酸、正二氫愈創酸和鄰氨基苯甲酸肉桂酯含量的計算。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：張洪非，唐綱嶺，邊照陽，陳再根，劉洋，楊飛，劉楠，劉珊珊，李中皓，姜興益，孫瑩瑩，邢軍，胡清源，
申請(專利權)人：國家煙草質量監督檢驗中心，
類型：發明
國別省市：