用于快速檢測嗜肺軍團菌的組合物和方法技術

本申請描述了可用于快速檢測嗜肺軍團菌(Legionella?pneumophila)的組合物和方法。所述組合物包括捕獲探針、擴增引物、引物組以及檢測探針，所述檢測探針包含與嗜肺軍團菌23SrRNA或編碼23S?rRNA的DNA靶序列雜交的核酸分子。還描述了使用實時PCT?rPCR或逆轉(zhuǎn)錄實時PCR(RT-rPCR)檢測和/或定量樣品中嗜肺軍團菌的量的方法。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術】領域本申請涉及用于檢測嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)的組合物和方法,并且更具體地涉及用于檢測嗜肺軍團菌23S rRNA靶序列的組合物和方法。背景嗜肺軍團菌在人類中引起軍團菌病和龐蒂亞克熱。性質(zhì)上它可以是社區(qū)獲得性的或醫(yī)院的，以及偶發(fā)性的或流行性的。其死亡率在無免疫應答的患者中可接近50%。已知軍團菌屬細菌也存留在諸如蓄水池的潮濕環(huán)境中，潮濕環(huán)境有利于通過諸如冷卻塔或飲用水分配系統(tǒng)的感染源傳播疾病。已描述了一些檢測軍團菌屬細菌的方法。識別水樣中嗜肺軍團菌的“金標準”程序是分離培養(yǎng)。使用專門的緩沖炭酵母提取物(BCYE)培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌是靈敏的和準 確的，但需要大約兩周以最大限度的恢復，然后用菌落形態(tài)、革蘭氏染色和血清學檢測相結合鑒定細菌。為了克服這些限制，已經(jīng)開發(fā)了利用PCR的免疫熒光方法和分子學方法。基于PCR的方法主要靶向嗜肺軍團菌的5S、16S和23S rRNA基因，以及巨卩遼細胞感染性增強蛋白(macrophage infectivity potentiator,mip)基因。已描述了實時PCR方法用于快速檢測軍團菌。雖然靶向嗜肺軍團菌mip基因的DNA的市售實時PCR試劑盒可得到，但是基于軍團菌DNA檢測的測定可能導致假陽性，因為在一定條件下細菌死亡后DNA不會像RNA —樣很快降解。因此，需要用于檢測嗜肺軍團菌的新的組合物和方法。專利技術概述本公開內(nèi)容提供可用于檢測樣品中嗜肺軍團菌且靶向23S rRNA或編碼23S rRNA的DNA的組合物以及方法。本公開內(nèi)容提供可用于分離嗜肺軍團菌核酸的捕獲探針，以及可用于擴增靶序列的PCR引物，以及選擇性結合靶序列并促進檢測靶序列的檢測探針。還提供了使用實時聚合酶鏈反應(rPCR)或逆轉(zhuǎn)錄酶實時聚合酶鏈反應(RT-rPCR)檢測嗜肺軍團菌的方法。任選地，使用實時PCR定量樣品中嗜肺軍團菌的量。本文所公開的核酸分子和方法對嗜肺軍團菌的23S rRNA或編碼23SrRNA的DNA有選擇性。如實施例2中所示，擴增引物和檢測探針對非軍團菌的微生物以及對非嗜肺軍團菌的物種具有選擇性。此外，如實施例3中所示，利用靶向23S rRNA的引物和檢測探針，RT-rPCR容易地擴增了有相似靈敏度的所有15個嗜肺軍團菌血清群。本文所述的檢測方法比通常需要兩周培育并識別軍團菌的“金標準”培養(yǎng)方法明顯更快。此外，本專利技術方法一般比依賴于免疫熒光或放射免疫測定的方法更為準確和靈敏。因此，在一個實施方案中，提供分離的核酸分子，其包含與SEQ IDNO :1-15中任何一個具有至少85%同一'丨生的序列或其互補物(complement)。在一個實施方案中，所述核酸分子包含與SEQ ID NO :1-15中任何一個具有至少90%、95%或99%同一性的序列或其互補物。在一個實施方案中，所述核酸分子與嗜肺軍團菌23S rRNA或編碼23S rRNA的DNA雜父。在另一個實施方案中，提供包含核酸分子和親和標記的捕獲探針，所述核酸分子包含與SEQ ID NO 1-6中任何一個具有至少85%同一性的序列或其互補物。任選地，所述核酸分子包含與SEQ ID NO :1-6中任何一個具有至少90%、95%或99%同一性的序列。在一個實施方案中，所述親和標記是生物素。任選地，所述親和標記綴合到所述核酸分子的5’ 端。在一個實施方案中，所述親和標記通過間隔分子(例如核酸)綴合到所述核酸分子。在一個實施方案中，提供適于擴增嗜肺軍團菌23S rRNA或編碼23SrRNA的DNA的引物，所述引物包含選自SEQ ID N0:l、7、12和13的某一序列。還提供了包含正向引物和反向引物的引物組，所述引物組適于擴增23S rRNA或編碼23S rRNA的DNA靶序列。在一個實施方案中，所述引物組包括包含與SEQ ID NO :1具有至少85%同一性的第一引物，以及包含與SEQ ID NO :7具有至少85%同一性的第二引物。在另一個實施方案中，所述引物組包括包含與SEQ ID NO :12具有至少85%同一性的第一引物，以及包含與SEQ ID NO: 13具有至少85%同一性的第二引物。另一個實施方案包含使用本文所述的引物組，通過PCR擴增嗜肺軍團菌23S rRNA 或編碼23S rRNA的DNA而產(chǎn)生的分離的核酸分子。在一個實施方案中，第一和第二引物具有SEQ ID NO :1和7的序列，而且通過PCR擴增而產(chǎn)生的所述分離的核酸分子包含SEQ ID N0:17的序列。在另一個實施方案中，第一和第二引物具有SEQ ID NO :12和13的序列，而且通過PCR擴增而產(chǎn)生的所述分離的核酸分子包含SEQ ID NO: 16的序列。在一個實施方案中，提供檢測探針，其包括a)核酸分子，其包含與SEQ ID NO :8、9、10、11、14和15中任何一個具有至少85%同一性的序列或其互補物，和b)可檢測的標記。在一些實施方案中，所述檢測探針與包含23S rRNA或編碼23S rRNA的DNA的靶序列雜交。在一個實施方案中，檢測探針與通過用本文所述引物組之一的PCR擴增而產(chǎn)生的核酸分子雜交。所述可檢測的標記可以是熒光團或產(chǎn)生可檢測信號的其他標記。在一個實施方案中，檢測探針包含通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)或接觸猝滅而與熒光團相互作用的猝滅劑。任選地，熒光團連接到所述核酸分子的5’端，而猝滅劑連接到所述核酸分子的3’ 端，所述檢測探針適用于實時PCR。本公開內(nèi)容還提供了可用于檢測嗜肺軍團菌的試劑盒。在一個實施方案中，所述試劑盒包含本文所述引物組的至少一個。在一個實施方案中，所述試劑盒包含檢測嗜肺軍團菌的說明書。任選地，所述試劑盒包含本文所述的一個或多個檢測探針或捕獲探針。在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于檢測樣品中嗜肺軍團菌的存在情況的方法，其包括a)提供疑似含有靶核酸的樣品，所述靶核酸含有嗜肺軍團菌23S rRNA或編碼23S rRNA 的 DNA ；b)將所述樣品與引物組接觸，所述引物組包括i)包含與SEQ ID NO :1具有至少85%同一性的第一引物，以及包含與SEQ ID NO: 7具有至少85%同一性的第二引物，或ii)包含與SEQ ID NO :12具有至少85%同一性的第一引物，以及包含與SEQ ID NO :13具有至少85%同一性的第二引物；c)用所述第一引物和第二引物擴增所述靶核酸以產(chǎn)生靶核酸擴增產(chǎn)物；和d)檢測靶核酸擴增產(chǎn)物的存在情況，其中所述靶核酸擴增產(chǎn)物的存在情況表示樣品中嗜肺軍團菌的存在情況。在一個實施方案中，使用聚合酶鏈反應(PCR)擴增所述靶核酸。在一個實施方案中，所述方法還包括用逆轉(zhuǎn)錄酶接觸所述樣品以產(chǎn)生編碼23SrRNA的DNA。在一個實施方案中，編碼23S rRNA的DNA是cDNA。在一個實施方案中，引物用于引導23S rRNA的逆轉(zhuǎn)錄， 所述引物包括選自SEQ ID N0:l、13、7和12的序列。在一個實施方案中，本文所述的方法使用實時PCR。例如，在一個實施方案中，使用實時PCR檢測靶核酸產(chǎn)物的存在情況。任選地，同時用所述靶的擴增來檢測靶核酸產(chǎn)物。在一些實施方案中，通過用本文所述的一個或多個檢測探針接觸靶核酸擴增產(chǎn)物而檢測靶核酸擴增產(chǎn)物的存本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：J·羅，蔡宏，陳靜，
申請(專利權)人：通用電氣公司，
類型：
國別省市：