質(zhì)粒載體制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)的目的在于提供為了在產(chǎn)業(yè)上有效地利用考克氏菌屬細(xì)菌而利用基因工程方法對(duì)考克氏菌屬細(xì)菌進(jìn)行修飾的技術(shù)。上述目的通過一種能夠在細(xì)菌內(nèi)自主復(fù)制的環(huán)狀質(zhì)粒來解決，所述環(huán)狀質(zhì)粒具有復(fù)制區(qū)，所述復(fù)制區(qū)包含：DNA結(jié)合蛋白樣蛋白基因的堿基序列；復(fù)制酶樣蛋白基因的堿基序列；和序列號(hào)45所示的堿基序列。作為上述質(zhì)粒，可以列舉例如來源于考克氏菌MBE131(Kocuria?sp.MBE131)株(FERM?P-21885)的包含序列號(hào)3或4所示的堿基序列的質(zhì)粒。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來華專利技術(shù)】
本專利技術(shù)涉及使用基因工程方法的有助于提高微生物的功能的技術(shù)。詳細(xì)而言，本專利技術(shù)涉及來源于考克氏菌屬(Kocuria)細(xì)菌的質(zhì)粒載體。
技術(shù)介紹
微球菌科(Micrococcaceae)細(xì)菌中的很多細(xì)菌在食品工業(yè)、藥品制造業(yè)、化學(xué) 工業(yè)、環(huán)境凈化等領(lǐng)域確認(rèn)到有用性。例如，在奶酪等乳制品的制作等中使用丙酸桿菌(propionibacteria)。另外,作為L(zhǎng)-谷氨酰胺的生產(chǎn)菌，已知有短桿菌屬(Brevibacteria)細(xì)菌。但是，這些細(xì)菌的野生株存在產(chǎn)物的生成能力低、培養(yǎng)困難等各種問題。因此，為了解決上述問題，正在嘗試通過對(duì)這些細(xì)菌實(shí)施基因操作來得到產(chǎn)物的生成能力、環(huán)境適應(yīng)性等得到提高的突變株。此時(shí)利用的是能夠在上述細(xì)菌中自主復(fù)制的質(zhì)粒等載體。例如，能夠用于丙酸桿菌的載體有作為專利文獻(xiàn)I的日本特開2002-112790號(hào)公報(bào)中記載的載體(特別將專利文獻(xiàn)I的記載作為公開的內(nèi)容援引到本說明書中)。作為屬于微球菌科的細(xì)菌，已知考克氏菌屬(Kocuria)細(xì)菌。考克氏菌屬細(xì)菌顯示出高度的耐有機(jī)溶劑性、耐重金屬性和增殖能力，因而期待其在燃料或醫(yī)藥化學(xué)產(chǎn)品的制造、環(huán)境凈化等領(lǐng)域中的應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
專利技術(shù)所要解決的問題但是，尚未獲知在考克氏菌屬細(xì)菌中穩(wěn)定保持外源性基因的技術(shù)。也沒有成功地使用該細(xì)菌并利用基因工程方法進(jìn)行微生物修飾的例子。結(jié)果，也不能賦予新的生物學(xué)功能或使原來的功能達(dá)到最佳化，因此，考克氏菌屬細(xì)菌在產(chǎn)業(yè)界中幾乎未得到應(yīng)用。因此，本專利技術(shù)中，專利技術(shù)所要解決的問題在于，提供為了在產(chǎn)業(yè)上有效地利用考克氏菌屬細(xì)菌而利用基因工程方法對(duì)考克氏菌屬細(xì)菌進(jìn)行修飾的技術(shù)。用于解決問題的手段本專利技術(shù)人為了解決上述問題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果，成功地從相模灣內(nèi)的深度約2000m的底泥中分離出具有大小較小且容易處理的環(huán)狀質(zhì)粒的新的考克氏菌屬細(xì)菌即考克氏菌 MBE131 (Kocuria sp. MBE131)株(FERM P-21885 ;以下有時(shí)也稱為 MBE131 株)。本專利技術(shù)人將由MBE131株獲取的質(zhì)粒命名為pKRIOO，將外源性基因和能夠在大腸桿菌內(nèi)自主復(fù)制的質(zhì)粒連接,構(gòu)建了 MBE131株和大腸桿菌的穿梭載體。將該穿梭載體導(dǎo)入MBE131株和大腸桿菌中，結(jié)果在任意一種細(xì)菌內(nèi)均表達(dá)外源性基因。此外,本專利技術(shù)人進(jìn)一步對(duì)質(zhì)粒pKRIOO進(jìn)行了研究,結(jié)果弄清了推測(cè)在質(zhì)粒pKRIOO中負(fù)責(zé)DNA復(fù)制的區(qū)域(復(fù)制區(qū))。接著，準(zhǔn)備在質(zhì)粒pKRIOO中不同于復(fù)制區(qū)的區(qū)域中插入外源性基因而得到的重組質(zhì)粒，將其導(dǎo)入作為與MBE131株不同的考克氏菌屬細(xì)菌的嗜根考克氏菌 DC2201 (Kocuria rhizophila DC2201)株(NBRC103217)中。結(jié)果，該重組質(zhì)粒在嗜根考克氏菌DC2201株中也能夠表達(dá)外源性基因并且能夠自主復(fù)制。本專利技術(shù)基于上述發(fā)現(xiàn)而完成。因此，根據(jù)本專利技術(shù)，提供一種能夠在細(xì)菌內(nèi)自主復(fù)制的環(huán)狀質(zhì)粒，其具有復(fù)制區(qū)，所述復(fù)制區(qū)包含=DNA結(jié)合蛋白樣蛋白基因的堿基序列；復(fù)制酶樣蛋白基因的喊基序列；以及序列號(hào)45所的喊基序列或在嚴(yán)格條件下與該喊基序列的互補(bǔ)堿基序列雜交的堿基序列。根據(jù)本專利技術(shù)的另一方面，提供一種能夠在細(xì)菌內(nèi)自主復(fù)制的環(huán)狀質(zhì)粒，其具有復(fù)制區(qū)，所述復(fù)制區(qū)包含DNA結(jié)合蛋白樣蛋白基因的喊基序列；復(fù)制酶樣蛋白基因的喊基序列；以及選自由DNA結(jié)合蛋白結(jié)合序列和重復(fù)基序組成的組中的至少一種序列。根據(jù)本專利技術(shù)的另一方面，提供一種能夠在細(xì)菌內(nèi)自主復(fù)制的環(huán)狀質(zhì)粒，其具有復(fù) 制區(qū)，所述復(fù)制區(qū)包含DNA結(jié)合蛋白樣蛋白基因的喊基序列；復(fù)制酶樣蛋白基因的喊基序列；以及包含選自由DNA結(jié)合蛋白結(jié)合序列和重復(fù)基序組成的組中的至少一種序列、氧化劑敏感性序列及反向重復(fù)序列的堿基序列。優(yōu)選本專利技術(shù)的質(zhì)粒在復(fù)制區(qū)中包含選自由DNA結(jié)合蛋白結(jié)合序列和重復(fù)基序組成的組中的至少一種序列中的I個(gè)以上的DNA結(jié)合蛋白結(jié)合序列以及2個(gè)以上的重復(fù)基序。優(yōu)選DNA 結(jié)合蛋白結(jié)合序列選自由 CACCGGTG、ACCGGTG、CCGGTG、ACCGGT、CACAGGT、CACCGGT、CACCGG、GTGCGCAC、GGCCGGCC、TCGGAGCTCCGA (序列號(hào) 46)、TCCCGGGA、TGCCGGCA、TGATCGATCA (序列號(hào)47)和GCACGTGC組成的組。優(yōu)選重復(fù)基序的重復(fù)單元選自由TGGCGTGGTCGTTG (序列號(hào)48)、GCGCTGGGGTG (序列號(hào) 49)、TGGGGCTGTGGTGG (序列號(hào) 5O)、GCGGTGGTG、GCGGTGGTGTG (序列號(hào) 5D、GGGCCGGGGTTG (序列號(hào) 52)、GCCGGGGTTGT (序列號(hào) 53)、TGGTCGTGTTG (序列號(hào) 54)、TGTTGCTGGGGTG (序列號(hào) 55)、TGGCGGTGTTGTGG (序列號(hào) 56)和 GGGGTGCCGGTGG (序列號(hào) 57)組成的組。優(yōu)選本專利技術(shù)的質(zhì)粒在復(fù)制區(qū)中包含I個(gè)以上的氧化劑敏感性序列。優(yōu)選氧化劑敏感性序列選自由TGTGGGGTGGCCCCTCAGCGAAATA (序列號(hào) 58)、GGCCTCTCAGC (序列號(hào) 59)、CTGCGGGCACCTCCTAC (序列號(hào) 60)、TTCGATGAG、GGTGAGGGGTAACCC (序列號(hào) 61)、GTGGGGTGGC (序列號(hào) 62)、GGGGGGTGGCTTCCTATCG (序列號(hào) 63)、GTGGGGTGGCCC (序列號(hào) 64)、TGTGGCGGCGGCACGTGCGCTAA (序列號(hào) 65)、GCGGGGGCACCCGA(序列號(hào) 66)和 CTGAGGGTCCTC (序列號(hào) 67)組成的組。優(yōu)選本專利技術(shù)的質(zhì)粒在復(fù)制區(qū)中包含I個(gè)以上的反向重復(fù)序列。優(yōu)選反向重復(fù)序列選自由GAAAAAGCCGGGCTGCTGCCCGGCTTTTTC (序列號(hào)68)和CACAGAAAAAGCCGGGTGGTAGAGCCCGGCTTITTCCGTG(序列號(hào) 69)組成的組。優(yōu)選復(fù)制酶樣蛋白基因的喊基序列為RepA蛋白基因的喊基序列。優(yōu)選復(fù)制酶樣蛋白基因的堿基序列為序列號(hào)2所示的堿基序列或在嚴(yán)格條件下與該堿基序列的互補(bǔ)堿基序列雜交且編碼具有復(fù)制酶活性的蛋白的堿基序列。優(yōu)選DNA結(jié)合蛋白樣蛋白基因的堿基序列為螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋蛋白基因的堿基序列。優(yōu)選DNA結(jié)合蛋白樣蛋白基因的堿基序列為序列號(hào)I所示的堿基序列或在嚴(yán)格條件下與該堿基序列的互補(bǔ)堿基序列雜交且編碼螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋蛋白的堿基序列。優(yōu)選復(fù)制區(qū)為序列號(hào)3所示的堿基序列或在嚴(yán)格條件下與該堿基序列的互補(bǔ)堿基序列雜交的堿基序列。優(yōu)選細(xì)菌為考克氏菌屬(Kocuria)細(xì)菌。根據(jù)本專利技術(shù)的另一方面，提供一種能夠在考克氏菌屬細(xì)菌內(nèi)自主復(fù)制的環(huán)狀質(zhì)粒，其中，作為限制性酶識(shí)別位點(diǎn)及其數(shù)量，以限制性酶識(shí)別位點(diǎn)數(shù)量的形式表示，包含SmaI :2、SphI U Sail K XhoI :1 和 BamHI :1。優(yōu)選本專利技術(shù)的質(zhì)粒依次包含限制性酶識(shí)別位點(diǎn)Smal、Smal、SphI, Sail、XhoI,BamHI 和 SacI。優(yōu)選本專利技術(shù)的質(zhì)粒的堿基對(duì)數(shù)為3. OX 103 3· 4 X IO3。優(yōu)選本專利技術(shù)的質(zhì)粒由以下的限制性酶圖譜(I)表示權(quán)利要求1.一種能夠在細(xì)菌內(nèi)本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來華專利技術(shù)】...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：大田優(yōu)佳莉，秦田勇二，森梢，中村信之，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：獨(dú)立行政法人海洋研究開發(fā)機(jī)構(gòu)，
類型：
國(guó)別省市：