馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化體的制造方法技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)的課題在于提供一種不使用特定的限制酶及其識(shí)別序列，而利用簡(jiǎn)單且有效地將DNA片段的末端聯(lián)結(jié)起來(lái)的方法制造馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化體的方法，以及使用該轉(zhuǎn)化體的有用物質(zhì)的制造方法等。由此，發(fā)現(xiàn)了下述解決手段：將不含馬克斯克魯維酵母菌的自主復(fù)制序列的二種以上的直鏈狀的雙鏈DNA片段導(dǎo)入馬克斯克魯維酵母菌，以通過(guò)所希望的DNA連接體表達(dá)的標(biāo)記基因的表達(dá)為指標(biāo)，選擇包含所希望的DNA連接體的轉(zhuǎn)化體，或者，將含有馬克斯克魯維酵母菌的自主復(fù)制序列的直鏈狀的雙鏈DNA片段單獨(dú)導(dǎo)入或與一種以上的其它直鏈狀的雙鏈DNA片段組合導(dǎo)入馬克斯克魯維酵母菌，以通過(guò)所希望的DNA連接體表達(dá)的標(biāo)記基因的表達(dá)為指標(biāo)，選擇包含所希望的DNA連接體的轉(zhuǎn)化體。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來(lái)華專(zhuān)利技術(shù)】
本專(zhuān)利技術(shù)涉及馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)轉(zhuǎn)化體的制造方法、使用該轉(zhuǎn)化體的有用物質(zhì)的制造方法等。
技術(shù)介紹
聯(lián)結(jié)DNA片段的末端制作任意DNA分子的技術(shù)，是以克隆為代表的眾多分子生物學(xué)領(lǐng)域中的實(shí)驗(yàn)操作所必需的基本技術(shù)。目前，用于連接DNA片段的最常用的手段，是一種用DNA連接酶將具有平末端的DNA分子與分子之間，或具有互補(bǔ)的突出末端的DNA分子與分子之間結(jié)合起來(lái)的手段。并且，作為應(yīng)用這種手段的克隆方法，已知Cohen-Boyer法(參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)I)，這種方法中，分別利用限制酶切斷插入DNA和載體并提純后，通過(guò)DNA連接酶使它們連接，制作目的構(gòu)建體，通過(guò)該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，使其擴(kuò)增。但是，在利用限制酶和DNA連接酶的DNA連接方法上，若不是預(yù)先以使得末端互相適合的方式制備的DNA·分子，就無(wú)法連接，因此，為了制作轉(zhuǎn)化用的構(gòu)建體，Cohen-Boyer法需要將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或限制酶處理等復(fù)雜的體外(in vitro)操作作為必要操作，并且，為了從轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌菌落中選出包含目的構(gòu)建體的大腸桿菌，需要大量時(shí)間。由于上述原因，要求開(kāi)發(fā)一種更為簡(jiǎn)便有效的DNA分子的連接方法。作為一種替代Cohen-Boyer法且不使用限制酶和DNA連接酶的克隆方法，已開(kāi)發(fā)出了體外同源重組法和體內(nèi)(in vivo)同源重組法。上述體外同源重組法是通過(guò)使用特定的重組酶和該酶的識(shí)別序列聯(lián)結(jié)DNA分子的方法，已知有Invitrogen公司的Gateway法、TaKaRa Bio公司的In-Fusion克隆法等。但是，由于在這些方法中，需要在插入DNA的兩端及載體上存在特定的DNA序列，因此，這些方法不能說(shuō)是通用性好的方法。此外，作為上述的體內(nèi)同源重組法，已知使用大腸桿菌(參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)2和3)和使用面包酵母的方法(參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)4和5)。這些體內(nèi)同源重組法，是利用了表達(dá)來(lái)自噬菌體的多種蛋白質(zhì)的大腸桿菌菌株或面包酵母具有極高的同源重組功能這一特性的方法。具體而言，通過(guò)制備在插入DNA的兩端添加了與克隆載體同源的序列的插入DNA及用限制酶等切斷了同源重組發(fā)生部分的克隆載體，并對(duì)大腸桿菌或面包酵母進(jìn)行轉(zhuǎn)化，由此可使得該轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)(體內(nèi))發(fā)生同源重組，獲得插入了插入DNA的克隆載體。由于這種反應(yīng)的發(fā)生與限制酶位點(diǎn)無(wú)關(guān)，因此，在載體序列中的各種位置均可插入DNA片段。而且，由于插入DNA的長(zhǎng)度，該方法還具有克隆效率不變的特點(diǎn)。但是，任一方法都是利用了同源重組的方法，因此，有必要向插入DNA添加與載體同源的序列。而且，對(duì)于使用了大腸桿菌的體內(nèi)同源重組法而言，為了獲得高的轉(zhuǎn)化效率，有需要進(jìn)行電穿孔且由于此操作而需要昂貴的裝置和器具等缺點(diǎn)。此外，對(duì)于使用面包酵母的體內(nèi)同源重組法而言，由于在大量制備DNA時(shí)要將克隆載體轉(zhuǎn)移至大腸桿菌，因此，需要使用面包酵母-大腸桿菌穿梭載體。但是，面包酵母-大腸桿菌穿梭載體并非通常使用的載體，其制備費(fèi)時(shí)費(fèi)力。此外，作為不使用限制酶和DNA連接酶，而進(jìn)行環(huán)狀DNA構(gòu)筑和擴(kuò)增的方法，已知有使用通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增法(rolling cycle)得到的直鏈DNA轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞,并在該轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)再構(gòu)筑環(huán)狀DNA的方法(參見(jiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)I)。但是，通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增法制作的擴(kuò)增DNA片段具有包含重復(fù)序列的特殊構(gòu)造，尚不明確該方法是否能夠應(yīng)用于不包含重復(fù)序列的DNA片段的環(huán)狀化。專(zhuān)利文獻(xiàn)I :日本特開(kāi)2005-229950號(hào)公報(bào)非專(zhuān)利文獻(xiàn)I Cohen SN et al. ,Proc Natl Acad Sci USA. 70，3240-3244 (1973)非專(zhuān)利文獻(xiàn)2 =Zhang Y et al.，Nat Genet. 20，123-128(1998)非專(zhuān)利文獻(xiàn)3 Yu D et al. , Proc Natl Acad Sci USA. 97，5978-5983 (2000)非專(zhuān)利文獻(xiàn)4 :Marykwas DL and Passmore SE, Proc Natl AcadSci USA. 92,11701-11705(1995) 非專(zhuān)利文獻(xiàn)5 :01denburg KR et al. , Nucleic Acids Res. 25,451-452 (1997)
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)的課題在于提供不使用特定的限制酶及其識(shí)別序列，簡(jiǎn)便且有效地聯(lián)結(jié)DNA片段的末端來(lái)制造馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化體的方法，以及使用該轉(zhuǎn)化體的有用物質(zhì)的制造方法。到目前為止本專(zhuān)利技術(shù)人等已經(jīng)證實(shí)，作為一種酵母的馬克斯克魯維酵母菌具有其它酵母所未被觀察到的多種優(yōu)異的性質(zhì)(PCT/JP2007/001270、PCT/JP2009/001214)。而且，在進(jìn)行涉及馬克斯克魯維酵母菌的轉(zhuǎn)化方法的研究的過(guò)程中已表明不含有同源序列的直鏈狀DNA被有效地并入了馬克斯克魯維酵母菌的基因組DNA中(NonklangS. et al. ApplEnviron Microbiol 74:7514-7521(2008))。從這些研究成果，本專(zhuān)利技術(shù)人等考慮是否可以將馬克斯克魯維酵母菌作為分子生物學(xué)研究的新工具來(lái)使用，于是，嘗試了使用馬克斯克魯維酵母菌來(lái)進(jìn)行新的DNA片段結(jié)合方法的開(kāi)發(fā)。首先，將含有URA3基因的從轉(zhuǎn)錄起始密碼子ATG的A到+771的序列的DNA片段和含有URA3基因的從+772到終止密碼子的序列的DNA片段導(dǎo)入為尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的馬克斯克魯維酵母RAK3605，并使用尿嘧啶缺陷型培養(yǎng)基進(jìn)行了培養(yǎng)。結(jié)果證明，可高效地獲得聯(lián)結(jié)了導(dǎo)入的DNA片段的DNA連接體含在基因組DNA中的轉(zhuǎn)化體。而且，本專(zhuān)利技術(shù)人等嘗試進(jìn)行了對(duì)此前未知的馬克斯克魯維酵母菌的自主復(fù)制序列(ARS)的鑒定，確定了序列號(hào)I 5所示的新ARS序列，同時(shí)發(fā)現(xiàn)通過(guò)將含有該ARS序列的直鏈狀DNA片段導(dǎo)入馬克斯克魯維酵母菌中，可制作環(huán)狀DNA連接體，由此完成了本專(zhuān)利技術(shù)。也就是說(shuō)，本專(zhuān)利技術(shù)涉及(I) 一種包含含有二種以上的直鏈狀的雙鏈DNA片段的DNA連接體的轉(zhuǎn)化酵母的制造方法，其特征在于依次包括步驟(a)和步驟(b)，其中，(a)為將不含自主復(fù)制序列的二種以上的直鏈狀雙鏈DNA片段導(dǎo)入馬克斯克魯維酵母菌的步驟，上述二種以上的直鏈狀的雙鏈DNA片段是下述二種以上的直鏈狀的雙鏈DNA片段，各雙鏈DNA片段單獨(dú)時(shí)不含有標(biāo)記基因的表達(dá)所需的全部序列，而只有當(dāng)多條雙鏈DNA片段連接而形成了所希望的DNA連接體時(shí)，才含有使標(biāo)記基因的表達(dá)成為可能的序列；(b)為以標(biāo)記基因的表達(dá)為指標(biāo)來(lái)選擇通過(guò)上述步驟(a)所得到的、上述所希望的DNA連接體被插入到基因組DNA中的轉(zhuǎn)化體的步驟，(2) 一種包含含有I種直鏈狀的雙鏈DNA片段的環(huán)狀DNA連接體的轉(zhuǎn)化酵母的制造方法，其特征在于依次包括步驟(a)和(b)，其中，(a)為將含有全部自主復(fù)制序列且含有標(biāo)記基因的表達(dá)所需的全部序列的I種直鏈狀的雙鏈DNA片段導(dǎo)入馬克斯克魯維酵母菌中的步驟；(b)為以標(biāo)記基因的表達(dá)為指標(biāo)來(lái)選擇通過(guò)上述步驟(a)所得到的、所希望的環(huán)狀DNA連接體的步驟，(3) —種包含含有二種以上的直鏈狀的雙鏈DNA片段的環(huán)狀DNA連接體的轉(zhuǎn)化酵母的制造方法，其特征在于依次包括步驟(a)和(b)，其中，(а)為將含有全部自主復(fù)制序列且含本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來(lái)華專(zhuān)利技術(shù)】...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：赤田倫治，星田尚司，B·M·A·阿布德?tīng)柊图{特，淺川潤(rùn)，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：國(guó)立大學(xué)法人山口大學(xué)，
類(lèi)型：
國(guó)別省市：