檢測安定的磁顆粒化學發光試劑盒及其應用制造技術

本發明專利技術涉及檢測安定的磁顆粒化學發光試劑盒，包括的試劑有：發光標記物、熒光素標記物、標準品、質控品、分離試劑。發光標記物是異魯米諾發光標記物標記的安定半抗原，熒光標記物是指熒光素或其衍生物標記的安定單克隆抗體，分離試劑是指包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠。本發明專利技術還涉及一種采用所述的試劑盒檢測動物源性食品中安定的方法，本方法對安定檢測具備較高的靈敏度、特異性和較快的檢測速度。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種化學發光檢測試劑盒及其測試方法。特別是檢測動物源性食品中安定的磁顆粒化學發光檢測試劑盒。
技術介紹
安定(Diazepam)作為一種鎮靜劑在畜禽中的應用日益廣泛，可以減少畜禽動物的運動量，增加動物的體重并可保證畜禽在長途運輸中不會產生應激反應。但動物大量攝取安定會導致藥物殘留于食品而被人體吸收，大劑量可產生中樞神經抑制，呼吸抑制等中毒表現。長期服用該類藥物可產生依賴性或成癮性，突然停藥可產生停藥反應，表現為抑郁、精神激動、失眠等。目前，用于安定殘留檢測的方法主要是高效液相色譜分析法(HPLC)和酶聯免疫法(ELISA)。高效液相色譜法操作繁瑣，檢測費用昂貴，對檢測人員要求高，耗時長，不利于推廣應用。酶聯免疫吸附法檢測需多步洗板步驟，相對耗時較長，難以提高操作自動化程度，，酶催化反應，對溫度的要求較高，試劑盒的穩定性較差。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題在于提供一種檢測安定的磁顆粒化學發光試劑盒，采用該試劑盒進行安定殘留的檢測時不僅具備較高的靈敏度，特異性，而且具有較高的反應速度。本專利技術的另一個目的在于提供一種安定殘留的測試方法，該方法操作簡單，靈敏度高，特異性好。實現上述目的，本專利技術提供一種安定殘留檢測試劑盒，其包含的主要試劑有發光標記物、突光素標記物、標準品、質控品、分離試劑。所述的分離試劑是包被有羊抗FITC抗體的順磁性納米微珠。所述的順磁性納米微珠，表面含有-OH、-COOH或-NH2活性基團的微珠，用于包被羊抗FITC單克隆抗體，其內芯是Fe3O4或Y -Fe2O3,使得微珠具有順磁性。所述的發光標記物是異魯米諾衍生物標記的安定殘留半抗原。所述的異魯米諾衍生物是 ABEI、AHEI 或 ABEN。所述的試劑盒還包括標準品,質控品和濃縮洗液。所述的熒光素標記物是FITC標記安定殘留單克隆抗體。本專利技術還提供一種利用試劑盒檢測安定殘留的方法，包括下列步驟I)分別吸取20 μ 1-100 μ I標準品或樣本，然后加入20 μ 1-100 μ I發光標記物，再加20 μ 1-100 μ I突光素標記物,充分混勻后,37°C溫育15min ；2)加入包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠80_150μ 1，混勻后在37°C溫育5min ；3)用磁分離架分離5min，棄上清后用清洗液300-500 μ I沖洗復合物沉淀；4)上述清洗步驟重復2-4次；5) 4)所得分離好的復合物直接放入測量暗箱，加入激發底物I和激發底物2，延遲3-5s后檢測發出的相對光強度(RLU)，樣本中的含量與RLU成一定比例關系，可以通過RLU集合標準曲線法計算安定殘留的濃度。所述的發光底物的主要成分是NaOH和H202。本專利技術中分析測試方法所用的分析儀是包括電源電路、自動注射泵I和2、測量室、發光室、光電倍增管計數器和輸出系統，同時還配置有計算機與中文界面的Windows控制軟件，可進行資料錄入、結果匯總、質量控制、結果儲存和結果查詢等功能，可完成多種分析模式的編程，定量或定性報告結果，自動生成并儲存、更新功能，兩點自動修正標準曲線，所采用的系統是CI-2008系統。 本專利技術所述的分離試劑是包被羊抗FITC單克隆抗體，其表面基團的含量是O. 1-0. 3eqm/g，其保存于 3-5% 卵清蛋白，O. 1-0. 2% Tween-20,0. 2 % NaN3, pH7. 2-7. 6 的PBS緩沖液中。所述的FITC是異硫氰酸熒光素。所述百分含量為質量百分含量。所述的發光標記物是異魯米諾衍生物ABEI、AHEI或ABEN標記的安定半抗原，其保存于含PH7. 2-7. 6,0. 1-0. 3% Tween-20,0. I % NaN3的PBS緩沖液中。所述百分含量是質量百分含量。所述的熒光素標記物是FITC標記的安定單克隆抗體，其保存于PH7. 2-7. 6，含3-5%卵清蛋白，O. 2% NaN3的PBS緩沖液。所述百分含量為質量百分含量。安定標準品溶液(Ong/ml,O.01ng/ml,0. 03ng/ml,0. lng/ml,O. 3ng/ml, I. Ong/ml)，標準品稀釋液為pH7. 2,0.3% NaN3,0. 05mol/L TRIS緩沖液。所述百分含量為質量百分含量。安定質控品溶液濃度分別為O. 02ng/ml,0. 8ng/ml,質控品稀釋液ρΗ7· 2,0.3%NaN3,0. 05mol/L TRIS緩沖液。所述百分含量為質量百分含量。所述的濃縮洗液為pH7. 2-7. 6,0. 2-0. 4% Tween-20,0. 2-0. 4% NaN3,0. I-O. 2mol/L PBS緩沖液。所述百分含量為質量百分含量。本專利技術的有益效果如下I)本專利技術試劑盒可特異性檢測安定殘留，對其他藥物無交叉。2)本專利技術試劑盒的靈敏度較高，對安定殘留的檢測靈敏度可達O. O lng/ml ο3)本專利技術試劑盒的檢測快捷，檢測時間低于20min。具體實施例方式實施例I試劑盒具體組分的制備I)安定半抗原的合成將安定和羧甲基羥胺縮合制備安定半抗原。2)安定人工抗原的制備將安定半抗原與牛血清白蛋白采用水溶性碳化二亞胺法進行偶聯得到免疫原。3)單克隆抗體的制備動物免疫以免疫原對Balb/c小鼠進行免疫，免疫劑量為100 μ g/只，使其產生抗血清。細胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按9 I比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，得到單克隆抗體的雜交瘤細胞株。細胞凍存和復蘇將雜交瘤細胞用凍存液制成IX IO9個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復蘇時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養瓶內培養。單克隆抗體的制備與純化將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油O. 5ml/只，7天后腹腔注射雜交瘤細胞5X IO7個/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進行純化，得到單克隆抗體。4)發光標記物的制備 取4. 5mmol/L ABEI,溶于4ml蒸懼水中，5. Ommol/L N-輕基琥拍酰亞胺溶于O. 5mlN，N-二甲基甲酰胺中，二者充分混勻后室溫反應3-4h。取上述制備的安定殘留半抗原15mg，用pH7. 4PBS調節體積到I. 5ml，然后加入上述活化的ABEI溶液，充分混勻后室溫反應過夜，過G-25凝膠柱純化。5)熒光標記物制備用O. 025mol/L, pH9. O的碳酸鹽緩沖液將安定殘留單克隆抗體稀釋成I %質量百分比濃度；根據欲標記的蛋白質總量，按每毫克免疫球蛋白加O. Olmg FITC，用分析天平準確稱取所需的FITC粉末。用同一緩沖液將FITC配成O. lmg/ml的溶液，按上述抗體溶液體積的3-5倍，混入FITC稀釋液；在4 。C避光條件下電磁攪拌、標記30-48h ;將標記溶液3000r/min，室溫離心20min，除去其中少量的沉淀物，裝入透析袋中，再pH7. 4的PBS緩沖液透析2-3天，期間至少更換透析液3次；取透析過夜的標記物,通過SephadexG-25或G_50柱，分離游離熒光素，收集標記的熒光標記物進行鑒定，分裝，貯存于4°C冰箱中。6)分離試劑制備a)磁珠活化表面-COOH基團的磁珠(購于DYNAL，粒徑為2. 8 μ m)，其含量是本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測安定的磁顆粒化學發光試劑盒，包括的試劑有：發光標記物、熒光素標記物、標準品、質控品、分離試劑。

【技術特征摘要】
1.一種檢測安定的磁顆粒化學發光試劑盒，包括的試劑有發光標記物、熒光素標記物、標準品、質控品、分離試劑。2.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的分離試劑是包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠。3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的順磁性納米微珠是里面包覆有Fe3O4或Y -Fe2O3,表面含有_0H、-COOH或-NH2活性基團的微珠。4.根據權利要求1-3任一項所述的試劑盒，其特征在于所述的發光標記物是異魯米諾衍生物標記的安定半抗原。5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述的異魯米諾發光標記物是ABEI、AHEI 或 AffiN。6.根據權利要求1-3任一項所述的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒還包括標準液、質控品和濃縮洗液。7.根據權利要求1-3之一所述的試劑盒，其特征在于所述的熒光素標...

【專利技術屬性】
技術研發人員：萬宇平，陳蘭珍，馮靜，楊秀賢，聶雯瑩，陳煒玲，
申請(專利權)人：北京勤邦生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：