本發(fā)明專利技術(shù)涉及檢測四環(huán)素類藥物的磁顆粒化學(xué)發(fā)光試劑盒，包括的試劑有：發(fā)光標(biāo)記物、熒光素標(biāo)記物、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、分離試劑。發(fā)光標(biāo)記物是異魯米諾發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的四環(huán)素類藥物半抗原，熒光標(biāo)記物是指熒光素或其衍生物標(biāo)記的四環(huán)素類藥物單克隆抗體，分離試劑是指包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠。本發(fā)明專利技術(shù)還涉及一種采用所述的試劑盒檢測動物源性食品中四環(huán)素類藥物的方法，本方法對四環(huán)素類藥物檢測具備較高的靈敏度、特異性和較快的檢測速度。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種化學(xué)發(fā)光試劑盒及其測試方法，特別是檢測水產(chǎn)、組織、牛奶、雞蛋、腎臟、肝臟、蜂王漿等樣本中四環(huán)素類藥物殘留量的磁顆粒化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒。
技術(shù)介紹
四環(huán)素類藥物(Tetracyclines, TCs)是由鏈霉菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素,在化學(xué)結(jié)構(gòu)上都屬于多環(huán)并四苯羧基酰胺母核的衍生物。在畜禽生產(chǎn)中，四環(huán)素類藥物被廣泛作為藥物添加劑，用于防治腸道感染、促生長和提高奶牛產(chǎn)奶量。同時也被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖和養(yǎng)蜂中預(yù)防和治療多種感染性疾病。但是由于四環(huán)素類藥物主要以原型經(jīng)腎小球過濾排出，殘留藥物能沉積于骨及牙 組織內(nèi)，與新形成的骨、牙所沉積的鈣相結(jié)合，導(dǎo)致牙齒持久成黃色，俗稱“四環(huán)素牙”，使出生的幼兒乳牙釉質(zhì)發(fā)育不全并出現(xiàn)黃色沉積，引起畸形或生長抑制。四環(huán)素類藥物還在肝組織中富集，造成肝損害，還可造成過敏反應(yīng)、二重感染、致畸胎影響。同時四環(huán)素藥物殘留易誘導(dǎo)耐藥菌株。因此四環(huán)素類藥物造成的食品殘留給人們身體健康帶來極大地隱患。在四環(huán)素類藥物的檢測方面，目前最常用的方法包括高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等方法。儀器方法操作繁瑣、耗時長、檢測費用昂貴，對檢測人員專業(yè)要求較高，樣本前處理方法復(fù)雜，儀器本身的價格也比較昂貴，不利于推廣應(yīng)用，酶聯(lián)免疫吸附法是基于抗原-抗體的特異性反應(yīng)，檢測靈敏度高，特異性較好，技術(shù)操作簡單，對食品安全快速檢測技術(shù)的發(fā)展起到了積極的促進(jìn)作用，但是ELISA方法存在一些缺陷，如非均相反應(yīng)，需要多步洗板過程，難以提高操作的自動化程度，酶催化反應(yīng)，對溫度的要求較高，試劑盒的穩(wěn)定性較差。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題在于提供一種四環(huán)素類藥物檢測試劑盒，采用該試劑盒進(jìn)行四環(huán)素類藥物的檢測時不僅具備較高的靈敏度，特異性，而且具有較高的反應(yīng)速度。本專利技術(shù)的另一個目的在于提供一種四環(huán)素的測試方法，該方法操作簡單，靈敏度高，特異性好。實現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)提供一種四環(huán)素類藥物檢測試劑盒，其包含的主要試劑有發(fā)光標(biāo)記物、突光素標(biāo)記物、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、分離試劑。所述的分離試劑是包被有羊抗FITC抗體的順磁性納米微珠。所述的順磁性納米微珠，表面含有-OH、-COOH或-NH2活性基團(tuán)的微珠，用于包被羊抗FITC單克隆抗體，其內(nèi)芯是Fe3O4或Y -Fe2O3,使得微珠具有順磁性。所述的發(fā)光標(biāo)記物是異魯米諾衍生物標(biāo)記的四環(huán)素半抗原。所述的異魯米諾衍生物是 ABEI、AHEI 或 ABEN。 所述的試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)控品和濃縮洗液。所述的熒光素標(biāo)記物是FITC標(biāo)記四環(huán)素類藥物單克隆抗體。本專利技術(shù)還提供一種利用試劑盒檢測四環(huán)素類藥物的方法，包括下列步驟I)分別吸取20 μ 1-100 μ I標(biāo)準(zhǔn)品或樣本，然后加入20 μ 1-100 μ I發(fā)光標(biāo)記物，再加20 μ 1-100 μ I突光素標(biāo)記物,充分混勻后,37°C溫育15min ；2)加入包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠80-150 μ 1，混勻后在37°C溫育5min ；3)用磁分離架分離5min，棄上清后用清洗液300-500 μ I沖洗復(fù)合物沉淀；4)上述清洗步驟重復(fù)2-4次；5) 4)所得分離好的復(fù)合物直接放入測量暗箱，加入激發(fā)底物I和激發(fā)底物2，延遲3-5s后檢測發(fā)出的相對光強(qiáng)度(RLU)，樣本中的含量與RLU成一定比例關(guān)系，可以通過RLU集合標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算四環(huán)素類藥物的濃度。 所述的發(fā)光底物的主要成分是NaOH和Η202。本專利技術(shù)中分析測試方法所用的分析儀是包括電源電路、自動注射泵I和2、測量室、發(fā)光室、光電倍增管計數(shù)器和輸出系統(tǒng)，同時還配置有計算機(jī)與中文界面的Windows控制軟件，可進(jìn)行資料錄入、結(jié)果匯總、質(zhì)量控制、結(jié)果儲存和結(jié)果查詢等功能，可完成多種分析模式的編程，定量或定性報告結(jié)果，自動生成并儲存、更新功能，兩點自動修正標(biāo)準(zhǔn)曲線，所采用的系統(tǒng)是CI-2008系統(tǒng)。本專利技術(shù)所述的分離試劑是包被羊抗FITC單克隆抗體，其表面基團(tuán)的含量是O. 1-0. 369111/^，其保存于含有2%牛血清蛋白，0· 2% Tween-20，O. 2疊氮化鈉，ρΗ7· 2的tris緩沖液中。所述的FITC是異硫氰酸熒光素。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。所述的發(fā)光標(biāo)記物是異魯米諾衍生物ABEI、AHEI或ABEN標(biāo)記的四環(huán)素半抗原，其保存于含PH7. 2,0. 2%吐溫-20，O. 2%疊氮化鈉的tris緩沖液中。所述百分含量是質(zhì)量百分含量。所述的熒光素標(biāo)記物是FITC標(biāo)記的四環(huán)素類藥物單克隆抗體，其保存于pH7. 4，3%酪蛋白，O. 3%疊氮化鈉的TRIS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品溶液(Ong/ml,O.5ng/ml, I. 5ng/ml,4. 5ng/ml, 13. 5ng/ml,40. 5ng/ml)，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為pH7. 4,0. 05%疊氮化鈉，0. 2mol/LTRIS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。四環(huán)素質(zhì)控品溶液濃度分別為O. 5ng/ml,6ng/ml,質(zhì)控品稀釋液pH7. 4,0. 05%疊氮化鈉，O. 2mol/LTRIS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。所述的濃縮洗液為PH7. 2,0. 3%吐溫-20，O. 2%疊氮化鈉，O. 2mol/L PBS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。本專利技術(shù)的有益效果如下I)本專利技術(shù)試劑盒可特異性檢測四環(huán)素類藥物。2)本專利技術(shù)試劑盒的靈敏度較高，對四環(huán)素類藥物的檢測靈敏度可達(dá)O. 5ng/ml。3)本專利技術(shù)試劑盒的檢測快捷，檢測時間低于20min。具體實施例方式實施例一試劑盒具體組分的制備I)四環(huán)素半抗原的合成將四環(huán)素與N，f -羰基二咪唑(⑶I)按摩爾比I : 2-1 4的比例溶解到無水吡啶中，在氮氣保護(hù)下，避光反應(yīng)3-5h，得到四環(huán)素半抗原。2)免疫原的制備將四環(huán)素半抗原與甲狀腺蛋白采用水溶性碳化二亞胺法進(jìn)行偶聯(lián)都到免疫原。3)單克隆抗體的制備動物免疫以免疫原對Balb/c小鼠進(jìn)行免疫，免疫劑量為100 μ g/只，使其產(chǎn)生抗血清。細(xì)胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按9 I比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，得到單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇將雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成IX IO9個/ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。單克隆抗體的制備與純化將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油O. 5ml/只，7天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5X IO7個/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行純化，得到單克隆抗體。4)發(fā)光標(biāo)記物的制備取4.5mmol/L ABEI,溶于4ml蒸懼水中，5. Ommol/L N-輕基琥拍酰亞胺溶于O. 5mlN，N-二甲基甲酰胺中，二者充分混勻后室溫反應(yīng)3-4h。取上述制備的四環(huán)素半抗原15mg，用pH7. 4PBS調(diào)節(jié)體積到I. 5ml，然后加入上述活化的ABEI溶液，充分混勻后室溫反應(yīng)過夜，過G-25凝膠柱純化。5)熒光標(biāo)記物制備用O. 025mol/L, pH9. O的碳酸鹽緩沖液將四環(huán)素單克隆抗體稀釋成I %質(zhì)量百分比濃度；根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白質(zhì)總量，按每毫克免疫球蛋白加O本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
一種檢測四環(huán)素類藥物的磁顆粒化學(xué)發(fā)光試劑盒，包括的試劑有：發(fā)光標(biāo)記物、熒光素標(biāo)記物、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、分離試劑。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種檢測四環(huán)素類藥物的磁顆粒化學(xué)發(fā)光試劑盒，包括的試劑有發(fā)光標(biāo)記物、熒光素標(biāo)記物、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、分離試劑。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的分離試劑是包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的順磁性納米微珠是里面包覆有Fe3O4或Y -Fe2O3,表面含有_0H、-COOH或-NH2活性基團(tuán)的微珠。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的試劑盒，其特征在于所述的發(fā)光標(biāo)記物是異魯米諾衍生物標(biāo)記的四環(huán)素類藥物半抗原。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述的異魯米諾發(fā)光標(biāo)記物是ABEI、AHEI 或 AffiN。6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)液、質(zhì)控品和濃縮洗液。7.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的試劑盒，其特征在于所述的熒光素標(biāo)記物是F...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：何方洋，馮才偉，孫震，劉福林，趙正苗，張?zhí)m娟，
申請(專利權(quán))人：北京勤邦生物技術(shù)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。