本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)涉及檢測(cè)蘇丹紅的磁顆粒化學(xué)發(fā)光試劑盒，包括的試劑有：發(fā)光標(biāo)記物、熒光素標(biāo)記物、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、分離試劑。發(fā)光標(biāo)記物是異魯米諾發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的蘇丹紅半抗原，熒光標(biāo)記物是指熒光素或其衍生物標(biāo)記的蘇丹紅單克隆抗體，分離試劑是指包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)還涉及一種采用所述的試劑盒檢測(cè)動(dòng)物源性食品中蘇丹紅的方法，本方法對(duì)蘇丹紅檢測(cè)具備較高的靈敏度、特異性和較快的檢測(cè)速度。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)涉及一種直接化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。特別是檢測(cè)辣椒油、辣椒醬、辣椒粉等樣本中阿維菌素藥物殘留的磁顆粒競(jìng)爭(zhēng)直接化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒。
技術(shù)介紹
蘇丹紅(Sudan I)是一種人工合成的紅色染料，常用作一種工業(yè)染料，被廣泛用于如溶劑、油、蠟、汽油的增色以及鞋、地板等增光方面。蘇丹以后啊染色劑含有“偶氮苯”，當(dāng)“偶氮苯”被降解后，就會(huì)產(chǎn)生“苯胺”，這是一種中等毒性的致癌物。過(guò)量的“苯胺”被吸入人體，可能會(huì)造成組織缺氧，呼吸不暢，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和其他臟器受損，甚至導(dǎo)致不孕癥。因其嚴(yán)重的致癌性、致敏性和遺傳毒性我國(guó)及歐盟等過(guò)已明文規(guī)定禁止其作為色素在食品中進(jìn)行添加，2005年2月18日，英國(guó)食品標(biāo)準(zhǔn)局(The FoodStandardAgency,FSA)就含添加蘇丹紅色素的食品向消費(fèi)者發(fā)出警告，并在其網(wǎng)站上公布了可能含有添加蘇丹紅色素的食品向消費(fèi)者發(fā)出警告，并在其網(wǎng)站上公布了可能含有蘇丹紅的產(chǎn)品清單。目前，常用的蘇丹紅殘留量的檢測(cè)主要有高效液相色譜法(HPLC)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等方法。I、高效液相色譜法(HPLC)具有檢測(cè)精度高、假陽(yáng)性率低的特點(diǎn)。HPLC法的主要缺點(diǎn)是儀器價(jià)格昂貴，操作比較繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，檢測(cè)費(fèi)用昂貴，對(duì)檢測(cè)人員專(zhuān)業(yè)要求較高，樣本前處理較復(fù)雜。2、酶聯(lián)免疫法(ELISA)是20世紀(jì)70年代出現(xiàn)，用于微量物質(zhì)的檢測(cè)，最早應(yīng)用于傳染病、腫瘤標(biāo)志物、激素水平等臨床檢測(cè)，90年代開(kāi)始在我國(guó)食品安全檢測(cè)領(lǐng)域推廣應(yīng)用，目前依托ELISA技術(shù)的試劑盒、試紙條已經(jīng)成為食品安全快速檢測(cè)領(lǐng)域的主導(dǎo)產(chǎn)品，同時(shí)也是我公司研發(fā)和銷(xiāo)售的主要產(chǎn)品類(lèi)型。酶聯(lián)免疫檢測(cè)法基于抗原-抗體的特異性反應(yīng)，檢測(cè)靈敏度較高、特異性較好，技術(shù)操作簡(jiǎn)易，容易掌握，確實(shí)解決了大量的以前難以解決的許多微量小分子物質(zhì)如抗生素、激素、農(nóng)藥殘留等的定性、定量分析工作，對(duì)食品安全快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展起到了積極的促進(jìn)作用。但是，ELISA方法存在許多自身無(wú)法克服的缺陷，主要表現(xiàn)在I)非均相反應(yīng)檢測(cè)過(guò)程中為分離游離物與結(jié)合物，需要多步洗板過(guò)程，耗時(shí)費(fèi)力，難以提高操作的自動(dòng)化程度。2)酶催化反應(yīng)借助酶催化底物顯色，測(cè)定反應(yīng)液吸光度值。反應(yīng)的時(shí)間與溫度對(duì)酶活力存在較大影響，試劑穩(wěn)定性差。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種檢測(cè)蘇丹紅的化學(xué)發(fā)光試劑盒，采用該試劑盒進(jìn)行蘇丹紅的檢測(cè)時(shí)不僅具備較高的靈敏度，特異性，而且具有較高的反應(yīng)速度。本專(zhuān)利技術(shù)的另一個(gè)目的在于提供一種蘇丹紅的測(cè)試方法，該方法操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，特異性好。實(shí)現(xiàn)上述目的，本專(zhuān)利技術(shù)提供一種蘇丹紅檢測(cè)試劑盒，其包含的主要試劑有發(fā)光標(biāo)記物、熒光素標(biāo)記物、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、分離試劑。所述的分離試劑是包被有羊抗FITC抗體的順磁性納米微珠。所述的順磁性納米微珠，表面含有-OH、-COOH或-NH2活性基團(tuán)的微珠，用于包被羊抗FITC單克隆抗體，其內(nèi)芯是Fe3O4或Y -Fe2O3,使得微珠具有順磁性。所述的發(fā)光標(biāo)記物是異魯米諾衍生物標(biāo)記的蘇丹紅半抗原。所述的異魯米諾衍生物是 ABEI、AHEI 或 ABEN。所述的試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)品,質(zhì)控品和濃縮洗液。 所述的熒光素標(biāo)記物是FITC標(biāo)記蘇丹紅單克隆抗體。本專(zhuān)利技術(shù)還提供一種利用試劑盒檢測(cè)蘇丹紅的方法，包括下列步驟I)分別吸取20 μ 1-100 μ I標(biāo)準(zhǔn)品或樣本，然后加入20 μ 1-100 μ I發(fā)光標(biāo)記物，再加20 μ 1-100 μ I突光素標(biāo)記物,充分混勻后,37°C溫育15min ；2)加入包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠80-150 μ 1，混勻后在37°C溫育5min ；3)用磁分離架分離5min，棄上清后用清洗液300-500 μ I沖洗復(fù)合物沉淀；4)上述清洗步驟重復(fù)2-4次；5)所得分離好的復(fù)合物直接放入測(cè)量暗箱，加入激發(fā)底物I和激發(fā)底物2，延遲3-5s后檢測(cè)發(fā)出的相對(duì)光強(qiáng)度(RLU)，樣本中的含量與RLU成一定比例關(guān)系，可以通過(guò)RLU集合標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算蘇丹紅的濃度。所述的發(fā)光底物的主要成分是NaOH和Η202。本專(zhuān)利技術(shù)中分析測(cè)試方法所用的分析儀是包括電源電路、自動(dòng)注射泵I和2、測(cè)量室、發(fā)光室、光電倍增管計(jì)數(shù)器和輸出系統(tǒng)，同時(shí)還配置有計(jì)算機(jī)與中文界面的Windows控制軟件，可進(jìn)行資料錄入、結(jié)果匯總、質(zhì)量控制、結(jié)果儲(chǔ)存和結(jié)果查詢(xún)等功能，可完成多種分析模式的編程，定量或定性報(bào)告結(jié)果，自動(dòng)生成并儲(chǔ)存、更新功能，兩點(diǎn)自動(dòng)修正標(biāo)準(zhǔn)曲線，所采用的系統(tǒng)是CI-2008系統(tǒng)。本專(zhuān)利技術(shù)所述的分離試劑是包被羊抗FITC單克隆抗體，其表面基團(tuán)的含量是O. l-o. 3eqm/g，其保存于含有 1_3%卵清蛋白，O. 01-0. 3% Tween-20,0. 02% NaN3,pH7. 2 的PBS緩沖液中。所述的FITC是異硫氰酸熒光素。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。所述的發(fā)光標(biāo)記物是異魯米諾衍生物ABEI、AHEI或ABEN標(biāo)記的蘇丹紅半抗原，其保存于含PH7. 2,0. 1-0. 3% Tween-20,0. 02% NaN3的PBS緩沖液中。所述百分含量是質(zhì)量百分含量。所述的熒光素標(biāo)記物是FITC標(biāo)記的蘇丹紅單克隆抗體，其保存于pH7. 2，含8-10%卵清蛋白，O. 02-0. 04% NaN3的PBS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液(Ong/ml,O. 02ng/ml, O. 05ng/ml, I. Ong/ml, 2. Ong/ml, 5. Ong/ml)，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為pH7. 2,0. 03% NaN3,0. lmol/L的PBS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。蘇丹紅質(zhì)控品溶液濃度分別為0. 03ng/ml，3. Ong/ml，質(zhì)控品稀釋液pH7. 2，0. 03% NaN3,0. lmol/L的PBS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。所述的濃縮洗液為pH7. 2-7. 4,0. 2-0. 4% Tween-20,0. 02-0. 04% NaN3,0. 2mol/LPBS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。本專(zhuān)利技術(shù)的有益效果如下I)本專(zhuān)利技術(shù)試劑盒可特異性檢測(cè)蘇丹紅，對(duì)其他藥物無(wú)交叉。2)本專(zhuān)利技術(shù)試劑盒的靈敏度較高，對(duì)蘇丹紅的檢測(cè)靈敏度可達(dá)O. 02ng/ml。3)本專(zhuān)利技術(shù)試劑盒的檢測(cè)快捷，檢測(cè)時(shí)間低于20min。具體實(shí)施例方式實(shí)施例一試劑盒具體組分的制備I)蘇丹紅半抗原的合成 將蘇丹紅用琥珀酸酐法合成蘇丹紅半抗原。2)蘇丹紅人工抗原的制備將蘇丹紅半抗原與人血清白蛋白(HSA)采用混合酸酐法進(jìn)行偶聯(lián)都到免疫原。3)單克隆抗體的制備動(dòng)物免疫以免疫原對(duì)Balb/c小鼠進(jìn)行免疫，免疫劑量為100 μ g/只，使其產(chǎn)生抗血清。細(xì)胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按9 I比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，得到單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。細(xì)胞凍存和復(fù)蘇將雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成IX IO9個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。單克隆抗體的制備與純化將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油O. 5ml/只，7天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5X IO7個(gè)/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行純化，得到本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種檢測(cè)蘇丹紅的磁顆粒化學(xué)發(fā)光試劑盒，包括的試劑有：發(fā)光標(biāo)記物、熒光素標(biāo)記物、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、分離試劑。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種檢測(cè)蘇丹紅的磁顆粒化學(xué)發(fā)光試劑盒，包括的試劑有發(fā)光標(biāo)記物、熒光素標(biāo)記物、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、分離試劑。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的分離試劑是包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的順磁性納米微珠是里面包覆有 Fe3O4或Y -Fe2O3,表面含有_0H、-COOH或-NH2活性基團(tuán)的微珠。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于所述的發(fā)光標(biāo)記物是異魯米諾衍生物標(biāo)記的蘇丹紅半抗原。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述的異魯米諾發(fā)光標(biāo)記物是ABEI、 AHEI 或 AffiN。6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)液、 質(zhì)控品和濃縮洗液。7.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的試劑盒，其特征在于所述的...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：何方洋，馮才偉，馬孝斌，李勇，朱亮亮，韓銳，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：北京勤邦生物技術(shù)有限公司，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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