本發明專利技術涉及一種鎘生物可利用度檢測的微生物細胞傳感器，適用于水體和土壤中鎘的生物可利用度的檢測。所述細胞傳感器包括：大腸桿菌E.coli，大腸桿菌E.coli作為宿主細胞承載重組質粒。重組質粒，重組質粒為含有鎘抗性系統cad啟動子、鎘抗性系統調控基因cadC、熒光素酶基因luc和T7終止子串聯序列的pUC18質粒。本傳感器對鎘的最短響應時間為5分鐘，對鎘的最低檢測濃度為0.01微摩爾/升，最高檢測濃度為50微摩爾/升，具有靈敏度高，響應速度快，成本低，操作簡單的特點，可廣泛運用于污染環境鎘的檢測和風險評價。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種檢測水體及土壤中鎘生物可利用度的微生物細胞傳感器的搭建及使用。
技術介紹
鎘(Cd)是危及人類健康的有毒物質之一，在美國毒物管理委員會(ATSDR)黑名單上名列第六，國際癌癥研究署(IARC)把鎘門類為第一類人類致癌物。鎘污染主要是由于人類長期進行污水灌溉、污泥及含鎘磷肥的大量施用、冶煉等行為造成的。鎘進入環境后即可影響水體和土壤質量，對生態系統造成風險，影響農產品安全質量，進而被傳遞進入食物鏈的頂端而輸脅人體健康。鎘進入人體后，主要累積在肝、腎、胰腺、甲狀腺和骨骼中，可使腎臟器官等發生病變，并影響人體的正常活動，造成貧血、高血壓、神經痛、骨質松軟、腎炎和分泌失調等病癥。我國土壤存在嚴重的重金屬污染問題，其中土壤鎘污染面積約為13300hm2，土壤鎘含量在在I 5mg · kg_\鎘污染治理工作迫在眉睫，對污染環境的鎘進行合理、準確的監測是開展污染防治工作的重要前提。目前監測和檢測重金屬污染物主要有兩種方法一種是物理化學分析法，如電感耦合等離子體原子發射光譜(ICP-AES)、電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)等，其優點是具備高檢測靈敏度和高特異性，但也存在一些不足，如儀器設備昂貴，操作復雜，檢測周期長，最重要的一點是，傳統的物理化學方法主要是對環境重金屬總量進行測定，不能檢測重金屬的生物可利用度；另一種方法是基于生物有機體的生物傳感器，其優勢是可以直接反映污染物對生物有機體的毒性及影響。微生物細胞具有易操作，繁殖及生存能力強，易儲存和穩定性高的特點，以微生物細胞為生物學感應元件的微生物細胞傳感器可以極大簡化傳感器的制作過程，提高傳感器的檢測效率。微生物細胞傳感器的微生物細胞含有一個由特異調控蛋白基因和報告基因組成的重組質粒。當宿主細胞的生長環境中有重金屬離子存在時，宿主細胞通過不同的機制吸收重金屬離子。當重金屬離子進入到胞內后，重組質粒或宿主染色體DNA編碼的轉錄調控蛋白被重金屬離子特異激活，與啟動子綁定或從啟動子上脫落，激活(“turn on”)或抑制(“turn off”)啟動子的啟動，進而調控下游報告基因表達，產生可檢測的信號，這種信號的變化強度與重金屬誘導物的濃度密切相關，轉錄調控蛋白對重金屬離子的識別能力和綁定能力決定著微生物全細胞傳感器的檢測特異性和靈敏度。微生物細胞傳感器已成為重金屬生物可利用度監測和風險污染評價的重要工具。
技術實現思路
本專利技術的目的在于針對現有的化學檢測方法不能反映鎘的生物可利用度且存在操作復雜、儀器價格昂貴等問題，利用金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureu pl258質粒鎘抗性操縱子cad的啟動子序列、調控蛋白基因cadC和商業化質粒pEGMluc的熒光素酶報告基因(Iuc)，構建了一種微生物細胞傳感器，從而提供了一種具有高靈敏度、低成本等特點的鎘生物可利用度檢測方法。構建該細胞傳感器的具體操作步驟為1、T7啟動子和報告基因的拼接以商業化質粒載體pRSET A. B. C為模板，PCR擴增得到T7啟動子片段fl ;以商業化質粒載體pGEM-luc為模板，PCR擴增得到熒光素酶報告基因Iuc片段f2 ;將片段Π和f2按一定比例混合，以混合液為模板，PCR擴增得到T7啟動子和報告基因Iuc的拼接片段f3 ； 2、包含T7啟動子的報告基因導入PUC18質粒對pUC18質粒用SacI與BamHI進行雙酶切處理，純化后得到載體vl ;對拼接序列f3用SacI與BamHI進行雙酶切處理，純化后得到片段f4 ;將片段f4連入載體vl，利用大腸桿菌E. coli作為宿主進行轉化，得到含有T7啟動子和報告基因Iuc的載體v2 ；3、載體v2中Iac啟動子的去除以pUC18為模板，擴增得到不含Iac啟動子的pUC18部分序列f5 ;對f5用SacI和HindIII進行雙酶切處理后純化得到片段fV ;對載體v2用SacI和HindIII進行雙酶切處理，純化后得到載體v3 ;將片段fV連入載體v3，利用大腸桿菌作為宿主進行轉化，得到含有T7啟動子和報告基因Iuc且去除Iac啟動子的載體v4 ；4、載體v4與T7終止子的拼接以pET30a為模板，擴增得到T7終止子片段f6 ;對片段f6用BamHI和HindIII進行雙酶切處理，純化后得到片段f6';對載體v4用BamHI和HindIII進行雙酶切處理，純化后得到載體v5 ;將片段f6'連入載體v5，利用大腸桿菌E. coli作為宿主進行轉化，得到受IPTG誘導表達的基礎型傳感器細胞；5、基礎型傳感器的表達能力驗證用2mM的IPTG誘導基礎型傳感器細胞，采用Varioskan Flash全波長掃描多功能酶標儀檢測其發射光譜以驗證基礎型傳感器細胞對報告基因的表達能力。6、目標質粒的構建以金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureu pl258質粒為模板,擴增得到包含cad啟動子和調控蛋白基因cadC的片度f7 ;對片段f7用SacI和XhoI進行雙酶切處理，純化后得到片段f7';對基礎型傳感器細胞質粒v6用SacI和XhoI進行雙酶切處理，純化后得到片段W ;將片段fT連入載體ν6'，利用大腸桿菌E. coli作為宿主進行轉化，得到目標質粒v7 ；7、目標傳感器細胞的搭建完成利用商業化宿主感受態細胞大腸桿菌E. coli DH5a為宿主，將目標質粒v7轉入宿主細胞得到可檢測鎘生物可利用度的微生物細胞傳感器。具體實施例方式以下實施例將對本專利技術作進一步的說明實施例I :第一步按種傳感器細胞單菌落于50mL三角瓶中，添加氨芐青霉素到終濃度為100 μ g/mL, 37°C，200r · mirT1 過夜培養；第二步取O. 5mL的上述菌液到14. 5mL的新鮮LB培養基中，37°C，200r ·ιιι η_1培養至 OD600 = 1.2 ；第三步將菌液用新鮮LB培養基稀釋至OD6tltl = 0.4 ；第四步取50 μ L稀釋后的菌液分別與鎘標準溶液、待測樣品等體積混合，30°C靜置誘導；第五步將40 μ L空載體細胞與50 μ L誘導培養液混合，加入IOyL IM K2HPO4 (pH7.8)和20mM EDTA的裂解緩沖液，_70°C條件下快速冷凍混合物lOmin，然后23°C水浴細胞3min,最后加入300 μ L新鮮配制的裂解混合物(見附錄)，混勻后室溫孵育IOmin ；第六步每個96孔板中加入20 μ L的裂解液，再加入100 μ L熒光素酶檢測液后， 用熒光檢測儀立刻檢測；第七步根據標準樣品誘導下傳感器細胞的熒光值，制作熒光強度和誘導物鎘濃度的標準曲線，利用標準曲線計算待測樣品的中鎘的相對濃度。附錄 IOmL裂解混合物配方5. 5mL 水2mL 5 X CCLR25mg BSA2. 5mL 溶菌酶混合液(5mL 配方0. 5mL IM K2HPO4 (pH 7· 8)與 20mM EDTA 的混合液，4. 5mL無菌水，25mg溶菌酶，混勻)T7啟動子序列CGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCG本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種微生物細胞傳感器，由細菌作基本材料，通過基因工程手段構建，用來檢測水體和土壤中鎘的生物可利用度。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：莊國強，侯啟會，馬安周，崔萌萌，王艷娟，
申請(專利權)人：中國科學院生態環境研究中心，
類型：發明
國別省市：
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