本發(fā)明專利技術(shù)提供了一株產(chǎn)丁二酸基因工程菌菌株，其分類命名為大腸埃希氏菌BA016（EscherichiacoliBA016），其保藏號(hào)登記號(hào)為CCTCC?NO：M?2012350。本發(fā)明專利技術(shù)還提供了該菌株的構(gòu)建方法與發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，通過(guò)過(guò)量共表達(dá)外源丙酮酸羧化酶和煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，使重組大腸桿菌能夠利用葡萄糖代謝生長(zhǎng)，減少副產(chǎn)物丙酮酸的生成，從而大幅度提高丁二酸的得率及生產(chǎn)強(qiáng)度。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物工程
，涉及產(chǎn)丁ニ酸基因工程菌及其構(gòu)建及應(yīng)用，具體涉及ー種高效利用葡萄糖生長(zhǎng)并產(chǎn)丁ニ酸基因工程菌^SdericAia coli BA016的構(gòu)建及其生產(chǎn)丁ニ酸的方法。
技術(shù)介紹
丁ニ酸，俗稱琥珀酸，作為ー種常見(jiàn)的天然有機(jī)酸，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，許多厭氧微生物生產(chǎn)丁ニ酸作為其能量代謝的主要末端產(chǎn)物。作為ー種優(yōu)秀的C4平臺(tái)化合物，丁ニ酸可被廣泛用于藥物、精細(xì)化工產(chǎn)品以及可生物降解的聚合物的前提，美國(guó)能源部的報(bào)告將丁ニ酸列為未來(lái)12種最有潛力的生物基大宗化學(xué)品中的第一位.。許多厭氧微生物能夠生產(chǎn)丁ニ酸作為其能量代謝的主要末端產(chǎn)物。傳統(tǒng)丁ニ 酸化學(xué)合成法采用以不可再生的戰(zhàn)略資源石油作為原料，環(huán)境污染嚴(yán)重，無(wú)法實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展。利用生物轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化可再生資源來(lái)生產(chǎn)丁ニ酸，成本低，污染小，環(huán)境友好，且在發(fā)酵過(guò)程中可吸收大量的CO2，有效減輕溫室效應(yīng)，近年來(lái)受到了各國(guó)科研人員的關(guān)注。在眾多的琥珀酸生產(chǎn)菌中，大腸桿菌具有培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、代謝網(wǎng)絡(luò)明確、易改造、易操作等特點(diǎn)，已成為生物法合成丁ニ酸的研究熱點(diǎn)。現(xiàn)有的產(chǎn)丁ニ酸大腸桿菌基因改造策略主要有增強(qiáng)代謝途徑中的關(guān)鍵酶(如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PCK)、失活或敲除競(jìng)爭(zhēng)途徑中的酶(如乳酸脫氫酶LDH、丙酮酸甲酸裂解酶PFL)、引入新的代謝途徑(如こ醛酸循環(huán))等。其中，E. coli NZNlll由于同時(shí)失活了丙酮酸甲酸裂解酶與乳酸脫氫酶，丙酮酸的代謝支路大大減少，丙酮酸大量積累，最終導(dǎo)致厭氧條件下菌株不能利用葡萄糖。其自發(fā)突變株疋coliAFPl 11由于突變了葡萄糖專性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的/7 tsG基因，菌株使用葡萄糖激酶系統(tǒng)進(jìn)行葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，使丙酮酸的積累不再是糖轉(zhuǎn)運(yùn)的限制因素，恢復(fù)了菌株在厭氧條件下利用葡萄糖的能力，且產(chǎn)物主要為丁ニ酸，在有氧厭氧兩階段發(fā)酵培養(yǎng)AFPlll過(guò)程中，丁ニ酸質(zhì)量收率達(dá)到96%，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.21 g じ1因此，在高產(chǎn)丁ニ酸大腸桿菌菌株構(gòu)建過(guò)程中，減少丙酮酸的積累是重組大腸桿菌高產(chǎn)丁ニ酸的關(guān)鍵因素之一。大腸桿菌中NAD(H)的生物合成及分解途徑如圖I所示，涉及其合成的基因主要有三個(gè)也，/ a^)，涉及分解代謝的基因主要有兩個(gè)lyjaD,yrfE、,而NAD+和NADH相互之間的轉(zhuǎn)化反應(yīng)則多達(dá)300多個(gè)。相關(guān)研究表明，利用DNA重組技術(shù)改造NAD (H)生物合成途徑是提高NAD(H)總量的有效手段。E. coli NZNlll由于同時(shí)失活了丙酮酸甲酸裂解酶與乳酸脫氫酶，NADH不能及時(shí)再生為NAD+，引起胞內(nèi)輔酶NAD 的不平衡(NADH/NAD+比例超過(guò)2)，最終導(dǎo)致厭氧條件下菌株不能利用葡萄糖。因此，在高產(chǎn)丁ニ酸大腸桿菌菌株構(gòu)建過(guò)程中，確保胞內(nèi)輔酶NAD(H)的平衡是重組大腸桿菌高產(chǎn)丁ニ酸的關(guān)鍵因素之一。San等人(Metab Eng, 2002, 4: 238-247 ；Metab Eng, 2002, 4: 182-192)在研究輔因子調(diào)控對(duì)大腸桿菌代謝流分布的影響過(guò)程中，通過(guò)過(guò)量表達(dá)煙酸轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶使胞內(nèi)NAD(H)總量提高了 41. 7% ;Heuser等人(Eng Life Sci, 2007, 7: 343-353)通過(guò)過(guò)量表達(dá)煙酸轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶和NAD合成酶，或者同時(shí)表達(dá)這兩個(gè)酶，使菌株胞內(nèi)NAD(H)總量提高了 2倍多，并將其應(yīng)用到酶轉(zhuǎn)化合成(R)-甲基-3_羥基丁胺過(guò)程中，使得NAD (H)的量不再成為限制因素，從而提高了酶轉(zhuǎn)化的效率。由于缺失了丙酮酸甲酸裂解酶基因/7/7ガ和乳酸脫氫酶基因ん導(dǎo)致丙酮酸的大量積累，反饋抑制PTS糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，使得菌體在厭氧條件下不能利用葡萄糖，并且生長(zhǎng)受到抑制。通過(guò)外源引入了漢中的丙酮酸羧化酶基因，使積累的丙酮酸流向草酰こ酸，解除丙酮酸的反饋抑制現(xiàn)象，進(jìn)而生成丁ニ酸。丙酮酸羧化酶PYC可以催化丙酮酸固定CO2生成草酰こ酸，過(guò)量表達(dá)該酶可以增加TCA還原臂碳流通量，從而有望提高丁ニ酸的產(chǎn)量。Vemuri等人將疋e中的/ ァc基因引入NZNlll中，結(jié)果丙酮酸減少了 3倍，丁ニ酸產(chǎn)量增加了 52%。岳方方等人在JM1307中過(guò)量表達(dá)枯草芽孢桿菌中的/^c基因，結(jié)果丁ニ酸的產(chǎn)量增加了 I. 9倍，同時(shí)丙酮酸的量也有所減少。因此本專利技術(shù)通過(guò)在萬(wàn).coli NZNlll中表達(dá)/7ァc廣/weガ基因，通過(guò)兩階段發(fā)酵，得到了高效利用葡萄糖產(chǎn)丁ニ酸的優(yōu)良菌株^ coli BAO160·
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，其技術(shù)目的在于提供一株能高效利用葡萄糖生長(zhǎng)并產(chǎn)丁ニ酸的基因工程菌株及其構(gòu)建方法，并利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)丁ニ酸。為實(shí)現(xiàn)本專利技術(shù)的技術(shù)目的，本專利技術(shù)采用以下技術(shù)方案 一、本專利技術(shù)提供了一株產(chǎn)丁ニ酸基因工程菌菌株，其分類命名為大腸埃希氏菌BA016(.Escherichia coli BA016)，其保藏號(hào)登記號(hào)為 CCTCC M 2012350。ニ、本專利技術(shù)同時(shí)提供上述的大腸埃希氏菌BA016的構(gòu)建方法，其特征在于以缺乏乳酸脫氫酶基因和丙酮酸甲酸裂解酶基因基因活性的菌株大腸桿菌NZNlll為出發(fā)菌株，通過(guò)過(guò)量共表達(dá)外源丙酮酸羧化酶和煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，得到能夠高效利用葡萄糖產(chǎn)丁ニ酸大腸埃希氏菌BAO16。進(jìn)ー步地,所述的具體構(gòu)建步驟如下 (1)以缺乏乳酸脫氫酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的萬(wàn).coliNZNlll菌株為出發(fā)菌株，得到同時(shí)缺乏ldM、pflB的感受態(tài)菌株； (2)純化擴(kuò)增出丙酮酸羧化酶基因(/7JC)，構(gòu)建得到表達(dá)丙酮酸羧化酶的表達(dá)質(zhì)粒pi'rc99a- pyc ； (3)純化擴(kuò)增出煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(/7/7M)，連接到步驟(2)所述的重組質(zhì)粒pTrc99a- 上，構(gòu)建得到過(guò)量共表達(dá)丙酮酸羧化酶和煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)質(zhì)粒pTrc99a- pyc- pncB ； (4)將步驟(3)中得到的質(zhì)粒導(dǎo)入步驟(I)中得到的感受態(tài)菌株，獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子； (5)利用步驟(4)得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子過(guò)量共表達(dá)丙酮酸羧化酶和煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，同時(shí)，減少丙酮酸的積累，得到可利用葡萄糖代謝產(chǎn)丁ニ酸基因工程菌大腸埃希氏菌BA016。三、利用本專利技術(shù)所述的大腸埃希氏菌BA016發(fā)酵生產(chǎn)丁ニ酸的方法其特征在于采用兩階段發(fā)酵方式，有氧階段提高生物量，厭氧階段發(fā)酵產(chǎn)酸。進(jìn)ー步地，具體步驟如下將大腸埃希氏菌BA016按體積比1%的接種量接種入有氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基中有氧培養(yǎng)，當(dāng)有氧培養(yǎng)菌體OD6tltl至0. 4 0. 6時(shí)用0. 5 mM的IPTG誘導(dǎo)至0D6(I(I=3吋，按接種量10%轉(zhuǎn)接至厭氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基中厭氧發(fā)酵。同時(shí)，上述的有氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基是現(xiàn)有技術(shù)中有氧培養(yǎng)產(chǎn)丁ニ酸大腸桿菌的常規(guī)培養(yǎng)基；厭氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基是以葡萄糖為碳源的產(chǎn)丁ニ酸大腸桿菌用發(fā)酵培養(yǎng)基。有益效果本專利技術(shù)提供的菌株的構(gòu)建方法簡(jiǎn)單方便，構(gòu)建得到的菌株發(fā)酵方法簡(jiǎn)單可行，易于エ業(yè)化，產(chǎn)酸能力強(qiáng)的目的，從而大大降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。附圖說(shuō)明 圖I大腸桿菌中含有PYC途徑的厭氧混合酸發(fā)酵途徑； 其中，矩形方塊處表示敲除失活的酶，虛線部分表示新構(gòu)建的途徑。圖2大腸桿菌中NAD(H)的生物合成及分解途徑。圖3重組質(zhì)粒pTrc本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一株產(chǎn)丁二酸基因工程菌菌株，其分類命名為大腸埃希氏菌？BA016（Escherichia？coli？BA016），其保藏登記號(hào)為CCTCC？M？2012350。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：姜岷，陳旭，梁麗亞，萬(wàn)青，茍冬梅，劉嶸明，馬江鋒，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：南京工業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
還沒(méi)有人留言評(píng)論。發(fā)表了對(duì)其他瀏覽者有用的留言會(huì)獲得科技券。