一種抗結核病藥物高通量篩選模型的構建方法技術

本發明專利技術提供了一種抗結核病藥物高通量篩選模型的構建方法，其是以內源性表達ESX-1分泌系統的海分枝桿菌為模式生物，選擇ESX-1分泌系統中C末端帶有信號肽的重要的毒力因子CFP-10蛋白與熒光素酶融合，構建外源表達CFP-10和熒光素酶融合蛋白的重組海分枝桿菌，向含有該重組菌的培養液中加入待篩選的藥物化合物，培養一定時間后取上清進行熒光素酶活性測定，以此來評價藥物對ESX-1分泌系統的抑制活性；同時，通過測定A600來監測海分枝桿菌的生長狀況。將此分析方法發展成高通量藥物篩選模型，篩選ESX-1分泌系統抑制劑，獲得既能降低結核分枝桿菌的致病性又不抑制其體外生長，即不易誘發耐藥的新型抗結核活性化合物。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及藥物高通量篩選模型的構建方法，具體地說，涉及。
技術介紹
結核病是ー種死亡率較高的感染性疾病，嚴重威脅著人類健康。全球約有三分之一的人感染了結核分枝桿菌，現有結核病人約2000萬，毎年新發生約900萬病人，死亡人數高達300萬。我國作為22個結核病的高發國家之一，結核病人數僅次于印度，位居世界第ニ，毎年死于結核病的人約25萬之多，是各類傳染病死亡人數總和的兩倍多。此外，感染了HIV的結核分枝桿菌攜帯者，由于病毒破壞了機體的免疫功能，發展為活動性結核病的可能 性比未感染HIV者高30 50倍，且結核的病程發展更快，更易致死。結核病加重了 HIV感染者或艾滋病人的疾病負擔，成為威脅人類健康的全球性公共衛生問題。由于耐藥及耐多藥結核分枝桿菌的出現，發展新型抗結核藥物，特別是抗耐藥結核藥物成為研究的重點，尋找抑制細菌生長的活性化合物是目前抗結核藥物研發的主要思路。現有的抗結核的一線藥物主要有利福平、異煙肼、こ胺丁醇、鏈霉素和吡嗪酰胺等，這些藥物多數是通過抑制結核分枝桿菌細胞壁合成或蛋白合成等細菌生存所必需的環節，直接抑制細菌的生長或者殺死細菌。在藥物產生的生存壓カ下，結核分枝桿菌通過突變作用靶點、增加藥物的外排、產生鈍化酶、改變膜的通透性等各種途徑，使原有的抗結核藥物逐漸失去效力，導致耐藥性的產生。據世界衛生組織最新報告顯示，全球范圍內幾種抗結核一線藥物的平均耐藥率依次為鏈霉素出.3%)、異煙肼(5.6%)、利福平(1.4%)、こ胺丁醇(0.8% )。所以，盡管具有新作用機制的藥物可以有效抑制這些耐藥菌的生長，但如何從根本上解決“藥物-耐藥-新藥-耐新藥”這ー循環性耐藥性問題，成為目前抗結核藥物研發的關鍵之一。本專利技術選擇結核分枝桿菌生長非必需但與其致病性密切相關的ESX-I分泌系統為藥物靶點，探索利用低藥物選擇性的毒力因子為靶點發展抗結核藥物的新策略，突破以抑制結核分枝桿菌生長為目標的傳統藥物研發思路，發展低藥物選擇壓カ的致病性抑制齊U，解決目前日趨嚴重的結核桿菌耐藥問題。致病細菌將其毒力因子分泌到胞外，可以促進細菌在宿主體內的繁殖和擴散并產生致病性。研究表明結核分枝桿菌的ESX-I分泌系統(VII型分泌系統)介導多種毒力因子的分泌，在結核桿菌的致病性中起著關鍵作用。ESX-I分泌系統在結核分枝桿菌的早期感染中發揮著重要的作用，參與結核分枝桿菌與宿主細胞早期的結合，引起細胞溶解，促進肉芽腫的形成，抑制吞噬體成熟，同時能夠調節宿主細胞的相關免疫反應，對減少感染的巨噬細胞的細胞因子分泌反應起重要作用。ESX-I分泌系統主要由RDl (region of differenceI)區編碼。該基因區在非致病性結核分枝桿菌和BCG疫苗株中是缺失的。RDl區包括9個基因(Rv3871 Rv3879c)，是結核分枝桿菌重要的毒力因子。ESAT_6(early secretedantigenic target of 6kD, Rv3875)和 CFP-10 (culture filtrate protein of IOkD,Rv3874)是最先被發現的兩個由ESX-I分泌系統分泌的蛋白。這兩種蛋白能夠形成I : I的ニ聚體結構來發揮毒カ效應。ESAT-6是ESX-I分泌系統中ー個重要的效應分子，當改變ESAT-6蛋白的個別氨基酸時不會抑制ESAT-6的分泌，但是會導致重組結核分枝桿菌毒力的減弱。CFP-IO和ESAT-6的協同分泌是分枝桿菌在巨噬細胞中増殖和抑制吞噬體成熟所必需的，其中C端起著重要的作用。CFP-10的C端具有信號序列能夠和細胞質蛋白Rv3871結合，信號序列位點的突變能夠阻止ESAT-6和CFP-10的分泌。Rv3869、Rv3870和Rv3877分別有1、3和11個轉膜位點，這3種蛋白同ESX-I分泌系統的Rv3871共同形成一個膜結合的ESX-I分泌復合體，通過ATP的水解轉運分泌蛋白。研究表明，Rv3870、Rv3871和Rv3877的突變株對巨噬細胞的毒カ減弱，并且在巨噬細胞的感染過程中引發弱化的免疫反應。如果將完整的RD-I區整合入BCG菌株后，ESAT-6蛋白的ESX-I分泌系統依賴性分泌能夠恢復。這些均表明ESX-I分泌系統是結核分枝桿菌關鍵的致病因素。
技術實現思路
本專利技術的目的是以結核分枝桿菌生長非必需但與其致病性密切相關的ESX-I分泌系統為藥物靶點，提供。 為了實現本專利技術目的，本專利技術的，其是通過構建外源表達來自于結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)中的CFP-10蛋白和報告蛋白的融合蛋白的重組海分枝桿菌，以該重組菌作為針對ESX-I分泌系統的抗結核病藥物高通量篩選模型，向含有該重組菌的培養液中加入待篩選的藥物化合物，培養一段時間后離心取上清測定報告蛋白的表達量或活性，以此來評價該藥物化合物對ESX-I分泌系統的抑制活性。其中，所述報告蛋白為熒光素酶、氯霉素こ酰基轉移酶、￠-半乳糖苷酶、分泌型堿性磷酸酶或熒光蛋白家族中的成員，優選熒光素酶。本專利技術還提供含有CFP-10蛋白和熒光素酶的融合蛋白以及編碼該融合蛋白的基因。本專利技術還提供含有上述基因的載體。優選地，其出發載體為PMV261。本專利技術還提供含有上述載體的宿主細胞。優選地，其為海分枝桿菌(Mycooacterium marinum)。本專利技術進一歩提供上述融合蛋白、編碼所述融合蛋白的基因、含有該基因的載體以及含有該載體的宿主細胞在篩選抗結核病藥物中的應用。相對于結核分枝桿菌而言，海分枝桿菌生長速度相對較快，存在ESX-I分泌系統且生物安全性較高，目前已廣泛用于結核病發病機制的研究。以內源性表達ESX-I分泌系統的海分枝桿菌為模式生物，選擇ESX-I分泌系統中C末端帶有信號肽的重要的毒力因子CFP-10蛋白與熒光素酶(Luciferase簡稱LUC)融合，構建外源表達CFP-10和熒光素酶融合蛋白的重組海分枝桿菌，向含有該重組菌的培養液中加入待篩選的藥物化合物，培養ー定時間后取上清進行熒光素酶活性測定，以此來評價藥物對ESX-I分泌系統的抑制活性；同時，通過測定A6tltl來監測海分枝桿菌的生長狀況。將此分析方法發展成高通量藥物篩選模型，篩選ESX-I分泌系統抑制劑，獲得既能降低結核分枝桿菌的致病性又不抑制其體外生長，即不易誘發耐藥的新型抗結核活性化合物。附圖說明圖I為本專利技術重組質粒pMV261-LUC-CFP-10的結構示意圖。圖2為反義DNA對重組海分枝桿菌MM-pMV261-LUC-CFP-10分泌活性的影響。圖3為重組海分枝桿菌發酵液上清與熒光值的量效關系曲線。圖4為熒光值分析結果的重復性實驗。具體實施例方式以下實施例用于說明本專利技術，但不用來限制本專利技術的范圍。以下實施中使用的質粒pMV261已在C. K. Stover等，New use of BCGfor recombinant vaccines. Nature 1991,351 :456-460 中公開，該質粒由法國UniversiteMontpellier II Laurent 博士惠贈。·實施例I抗結核病藥物高通量篩選模型的構建流程I. I 質粒 pMV261-LUC-CFP-10 的構建以質粒pGL4 (購自 Promeg本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種抗結核病藥物高通量篩選模型的構建方法，其特征在于，其是通過構建外源表達來自于結核分枝桿菌(Mycobacterium？tuberculosis)中的CFP？10蛋白和報告蛋白的融合蛋白的重組海分枝桿菌，以該重組菌作為針對ESX？1分泌系統的抗結核病藥物高通量篩選模型，向含有該重組菌的培養液中加入待篩選的藥物化合物，培養一段時間后離心取上清測定報告蛋白的表達量或活性，以此來評價該藥物化合物對ESX？1分泌系統的抑制活性。

【技術特征摘要】
1.一種抗結核病藥物高通量篩選模型的構建方法，其特征在于，其是通過構建外源表達來自于結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)中的CFP-10蛋白和報告蛋白的融合蛋白的重組海分枝桿菌，以該重組菌作為針對ESX-I分泌系統的抗結核病藥物高通量篩選模型，向含有該重組菌的培養液中加入待篩選的藥物化合物，培養一段時間后離心取上清測定報告蛋白的表達量或活性，以此來評價該藥物化合物對ESX-I分泌系統的抑制活性。2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述報告蛋白為熒光素酶、氯霉素こ酰基轉移酶、3 -半乳糖苷酶、分泌型堿性磷酸酶或熒...

【專利技術屬性】
技術研發人員：岑山，賈平平，張義，李曉宇，周金明，殷霄，
申請(專利權)人：中國醫學科學院醫藥生物技術研究所，
類型：發明
國別省市：