本發明專利技術公開了一種結核/HIV抗原肽雙特異性TCR、其重組逆轉錄病毒載體與應用。本發明專利技術篩選出結核肽Ag85B199-207(KLVANNTRL)和HIV肽Env120-128(KLTPLCVTL)雙特異的TCR，利用逆轉錄病毒載體將其轉染到CD8+T細胞中，獲得表達結核肽Ag85B199-207(KLVANNTRL)和HIV肽Env120-128(KLTPLCVTL)雙特異TCR的CD8+T細胞。CD8+T細胞可成功表達外源性TCR基因，特異性識別結核肽Ag85B199-207(KLVANNTRL)和HIV肽Env120-128(KLTPLCVTL)并介導IFN-γ、TNF-α、GrB細胞因子分泌和細胞毒活性，這種雙特異性使得即使其中一種病原體發生突變產生免疫逃逸時，仍可對另一種病原體產生反應。該方法制備的逆轉錄病毒載體具有結核/HIV共感染疾病基因治療的應用價值，可為結核/HIV共感染的過繼細胞免疫治療開辟新徑。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物工程領域，具體涉及一種結核/HIV抗原肽雙特異性T細胞受體(TCR)，以及利用該TCR制備得到的一種用于結核/HIV共感染基因治療的逆轉錄病毒載體，逆轉錄病毒載體轉染得到的CD8+ T細胞及其在制備抗結核/HIV共感染疾病藥物中的應用。
技術介紹
結核(Tuberculosis, TB)是全球最致命的慢性感染疾病之一。近十年來，由于全球流動人口增加，結核病防治工作受到忽視，多藥耐藥結核菌廣泛流行，免疫抑制劑大量使用，尤其是HIV與結核分枝桿菌并發感染，致使結核病重新蔓延，全球疫情再度惡化。結核潛伏感染者一旦感染HIV，機體免疫系統會被加速破壞，減弱甚至喪失對結核分枝桿菌的抑制效應，患者更容易發展成活動性結核；同時，結核分枝桿菌通過刺激單核細胞和巨噬細胞 大量分泌單核細胞趨化蛋白-I (MCP-I)促進HIV的轉錄，加速病毒增殖，促使病情惡化。2010年全球新增結核病人880萬，其中110萬共感染HIV ;全球結核死亡人數140萬，其中1/4為合并感染HIV致死。目前，TB/HIV雙重感染者的治療主要是抗TB與抗逆轉錄病毒治療的結合，其療程長，多種藥物相互作用，藥物重疊的毒副作用大，易產生耐藥性，病人服藥依從性差，對這兩種疾病同時有效的藥物稀缺，整合抗TB與抗逆轉錄病毒治療存在時間和藥物選擇的巨大挑戰，以及出現免疫重建炎癥綜合癥等問題。因此，亟需開發針對TB/HIV共感染行之有效的治療方法。抗TB與抗HIV感染的免疫機制都是以T細胞介導的細胞免疫為主。已有大量實驗證據表明，抗原特異性⑶8+ T細胞在控制TB和HIV感染中發揮著至關重要的作用。效應CD8+ T細胞通過以下三種途徑來發揮作用1)發揮細胞毒作用，通過穿孔素和顆粒酶B (granzyme B)途徑直接殺傷感染靶細胞；2)釋放Thl型細胞因子，如干擾素-Y(interferon- Y , IFN-Y )、腫瘤壞死因子-a (tumor necrosis factor- α , TNF-α),抑制病原體復制，促進巨噬細胞清除胞內病原體；3)介導Fas/FasL殺傷機制，直接殺傷靶細胞。而在TB/HIV共感染者體內，效應⑶8+ CTL數量和反應水平均很低。因此，通過過繼轉移大量效應⑶8+ T細胞至TB/HIV共感染者體內，可增強其抗TB/HIV感染的能力。過繼細胞免疫治療已在抗TB和HIV感染中顯示了巨大潛力。利用滅活的結核菌體外致敏PBL，將其回輸給多藥耐藥肺結核患者，取得良好療效。將患者自體HIV特異性CD8+CTL過繼回輸治療6例HIV感染者，最初2周所有患者⑶4計數增加，5名患者血漿病毒血癥減少。24周后，2名患者的HIV病毒負載繼續減少，另I名患者⑶4計數增加超過2倍。盡管過繼細胞免疫治療展現出光明的前景，但這種方法的普遍應用卻存在許多障礙。我們很難從處于疾病進展期的患者體內分離出效應T細胞，因為此時CTL反應是不斷消耗的，接受長期治療的個體也是如此，因為隨著病原體負載減少，針對病原體的CTL反應也減少。另夕卜，從患者體內分離出的T細胞往往是已最終分化的，很難擴增。即使可以擴增，回輸患者體內后其存活時間也很短。而通過抗原特異T細胞受體基因修飾初始T細胞，人為賦予普通T細胞識別特異抗原的能力，短期內獲得大量效應T細胞，則可有效解決這一問題。T細胞抗原受體(T cell receptor, TCR)是所有T細胞表面的特征性標志，在T細胞抗原識別中起關鍵作用。TCR是由α、β兩條肽鏈構成的異二聚體，每條肽鏈又可分為可變區(V區)，恒定區(C區)，跨膜區和胞質區等幾部分；其胞質區很短，信號傳遞主要通過與其以非共價鍵結合的CD3分子進行。TCR分子屬于免疫球蛋白超家族，其抗原特異性存在于V區；V區(Va、νβ)又各有三個高變區⑶R1、⑶R2、⑶R3，其中以⑶R3變異最大，直接決定了 TCR的抗原結合特異性。在TCR識別MHC-抗原肽復合體時，⑶R1XDR2識別和結合MHC分子抗原結合槽的側壁，而CDR3直接與抗原肽相結合。根據TCR να、νβ基因的同源性，可將80多個TCR Va基因分為32個家族、60多個TCR νβ基因分為24個家族。利用每個T細胞克隆均有其獨特CDR3序列的特點，采用CDR3譜型分析技術，可測定各TCR家族各CDR3出現的頻率，由此反映T細胞的克隆性。未接受抗原刺激的T細胞中，針對各種抗原的T細胞克隆分布均勻，表現為多家族和多克隆性，具體地，表現為各家族均出現呈高斯分布的約8個CDR3峰；抗原刺激則引起識別該抗原 的某一個或幾個特異TCR家族T細胞反應性增生，表現為該家族CDR3成員出現少于4個峰的寡克隆或單克隆分布，其中具有單克隆CDR3分布(表現為單峰)的TCR家族即是抗原特異單克隆增生的TCR家族。對該家族PCR產物進行測序，可獲得抗原特異TCR CDR3序列。
技術實現思路
本專利技術的目的在于篩選出結核肽Ag85B199_2Q7 (KLVANNTRL)和HIV肽Eiw12ch128(KLTPLCVTL)雙特異的TCR，利用逆轉錄病毒載體將其轉染到CD8+ T細胞中，獲得表達結核肽 Ag85B199_207 (KLVANNTRL)和 HIV 肽 Env120^128 (KLTPLCVTL)雙特異 TCR 的 CD8+ T 細胞，以及該經過TCR基因修飾的CD8+ T細胞在制備抗結核/HIV共感染疾病藥物中的應用。本專利技術所采用的技術方案是一種結核/HIV抗原肽雙特異性T細胞受體(TCR)，包括α鏈和β鏈，其中，α鏈的⑶R3區含有SEQ ID NO: 3所述的序列；β鏈的⑶R3區含有SEQ ID NO: 4所示的序列。所述TCR的α鏈是由SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾后所得到的能特異與外源性β鏈裝配成TCR蛋白分子的氨基酸序列；β鏈是由SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾后所得到的能特異與外源性α鏈裝配成TCR蛋白分子的氨基酸序列。優選的，所述TCR的α鏈氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示，β鏈氨基酸序列如SEQ ID NO: 8 所示。編碼上述結核/HIV抗原肽雙特異性TCR的基因。一種結核/HIV抗原肽雙特異性TCR的融合基因，其序列如SEQ ID NO: 13所示。一種重組逆轉錄病毒載體，含有編碼結核/HIV抗原肽雙特異性TCR的基因。所述逆轉錄病毒載體的出發載體為pMX-IRES-GFP、pMCs-IRES-GFP或pMYx-IRES-GFP。上述重組逆轉錄病毒載體經包裝后得到的逆轉錄病毒。上述逆轉錄病毒轉染的⑶8+T細胞。結核/HIV抗原肽雙特異性TCR、編碼該TCR的基因，含有該基因的重組逆轉錄病毒載體、逆轉錄病毒、該逆轉錄病毒轉染的CD8+T細胞在制備抗結核病、艾滋、艾滋/結核共感染疾病藥物中的應用。具體步驟流程如下 I、篩選出結核肽 Ag85B199_2Q7 (KLVANNTRL)和 HIV 肽 Env12(l_128 (KLTPLCVTL)雙特異的TCR ①淋巴細胞分離液分離HLA-A*0201型健康志愿者外周血單個核細胞(peripheralbloo本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種結核/HIV抗原肽雙特異性T細胞受體（TCR），包括α鏈和β鏈，其中，α鏈的CDR3區含有SEQ？ID？NO:？3所述的序列；β鏈的CDR3區含有SEQ？ID？NO:？4所示的序列。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：馬驪，周超穎，溫茜，羅微，
申請(專利權)人：南方醫科大學，
類型：發明
國別省市：
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