一種創制結縷草高頻再生系的方法技術

本發明專利技術公開了一種創制結縷草高頻再生系的方法。本發明專利技術提供一種創制結縷草高頻再生系的方法，包括如下步驟：將單粒結縷草種子依次經誘導培養、第一次繼代培養、第二次繼代培養、第三次繼代培養，得到結縷草高頻再生系。本發明專利技術的實驗證明，本發明專利技術提供了一種創制結縷草高頻再生愈傷組織系或再生植株及專用培養基，本發明專利技術通過篩選日本結縷草品種，以單粒種子為外植體，分別誘導出不同的愈傷系，經培養基配比組合和多次干化繼代培養，篩選出分化能力強的愈傷系，每一系增殖的大量高頻再生愈傷組織均為同質。最終，建立一種創制結縷草高頻再生系的方法，為提高結縷草組織培養再生率和遺傳轉化效率提供實用方法。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及植物組織培養領域，尤其涉及。
技術介紹
草坪草具有景觀功能、生態功能和運動功能。隨著經濟的快速發展和人民生活水平的不斷提高，草坪對于城市的綠化和環境改善起著越來越重要的作用。人們利用有性雜交、輪回選育等常規育種手段培育出一些草坪草新品種。轉基因技術具有可以定向改良、打破生殖隔離等優點，是草坪草遺傳改良的一種非常有前途的手段。草坪草與其他植物一樣，組織培養是遺傳轉化操作的前提。目前，盡管有不少報道已建立了各草種的再生體系，但由于大多數草坪草屬異花授粉植物，遺傳背景復雜，組織培養比其他植物更具有難度。 力和抗逆性，尤其以超群的耐踐踏、耐瘠薄和抗病能力而著稱。結縷草被譽為“最有前途”的草種，其形成的草坪彈力是早熟禾的30-40倍，耗水量比草地早熟禾少30-40%，建植和管理費用比早熟禾低80%左右(胡叔良，1997，發展草坪綠地關鍵問題的探討，中國草地，5 (2)67-70)。正是由于結縷草所具有的這些獨特的優良性狀，使它們成為運動場、開放綠地、邊坡綠化以及水土保持的重要草種，也是適合我國水資源貧乏國情的草坪草種。同時，結縷草也是我國唯一具有出口創匯能力的草種。因此，建立穩定高效的結縷草組織培養體系不僅具有重要的理論意義，還有實際應用價值。在結縷草組織培養和遺傳轉化方面，前人已做過一些探索和研究，并取得了一定的研究成果。早在1987年，Al-Khayri等以日本結縷草成熟胚作為實驗材料，通過切離成熟胚誘導愈傷組織，最終獲得再生植株(Al-Khayri J M, Huang F H, Thompson LF, etal.1987, In vitro plant regeneration of zoysia grass(Zoysia japonicaSteud. ). InVitro,23:3;Al-Khayri J M，Huang F H，Thompson L F，et al.1989,Plant regenerationof zoysia grass from embryo-derived callus. Crop Science, 29 (5):1324-1325)。但結縷草種子較小，成熟胚的分離操作相對困難，限制其廣泛應用。Inokuma等在1996年首次報道通過培養日本結縷草懸浮細胞系，用純化得到的原生質體再生出植株(IN0KUMAC，SUGIURA K，CHO C，et al. 1996, Plant regenerationfrom protoplasts of Japaneselawn grass. Plant Cell Reports, 15(10) :737_741)。但該操作不僅比較繁瑣，而且再生率較低。之后，人們又以結縷草幼穗、幼胚和根莖作為外植體，試圖通過體胚發生途徑獲得再生植株(Ν0Η H Y，CHOI J S，AHN B J. 1995，Plant regeneration through somaticembryogenesis in zoysia grasses(Zoysiaspp.). Journal of the Korean Society forHorticultural Science，36 (4) : 582-587 ;玄松南，陳慧哲，傅亞萍，等.1997，兩種草坪草愈傷組織的誘導及其分化研究.浙江農業學報，9:295-299 ;GE Yaxin, TINA Norton, WANGZeng-Yu. 2006, Transgeniczoysiagrass(Zoysia japonica)plants obtained by Agrobacterium-mediatedtransformation. Plant Cell Rep, 25:792 - 798),但該方法不僅取材受季節所限，無菌外植體的獲得也是一個難題。不管以哪種外植體再生植株，均有諸多因素影響再生率(齊春輝，韓烈保，黃麟，等.2005，幾種因素對日本結縷草愈傷組織誘導與生長影響的研究.四川草業，4:1-3;張俊衛，唐蜻，包滿珠.2006，日本結縷草成熟種子愈傷組織誘導及植株再生的影響因子分析.中國農業科學，39(2) :368-374)。目前，尚未見有關結縷草高頻再生系的創制方法相關報道或專利。
技術實現思路
本專利技術的一個目的是提供一種創制結縷草再生愈傷組織系的方法。本專利技術提供的方法，包括如下步驟將單粒結縷草種子依次經誘導培養、第一次繼代培養、第二次繼代培養、第三次繼代培養，得到結縷草再生愈傷組織系。上述方法中，上述誘導培養、所述第一次繼代培養、所述第二次繼代培養和所述第三次繼代培養采用的培養材料均源自同一個種子。上述方法中，所述誘導培養為將所述結縷草種子在誘導培養基中誘導培養，得到誘導愈傷組織； 所述第一次繼代培養為將所述誘導愈傷組織在第一代繼代培養基中第一代繼代培養，得到第一次愈傷組織；所述第二次繼代培養為將所述第一次愈傷組織在第二代繼代培養基中第二代繼代培養，得到第二次愈傷組織；所述第三次繼代培養為將所述第三次愈傷組織在第三代繼代培養基中第三代繼代培養，得到再生愈傷組織系；所述誘導培養基為在液體MS培養基中添加具有如下終濃度的各組分終濃度2mg/L的2，4-D(2，4- 二氯苯氧乙酸)、終濃度的O. 15mg/L 6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)、終濃度30g · Γ1的蔗糖、終濃度7. Og · Γ1的瓊脂、終濃度O. 5g · Γ1的水解酪蛋白、終濃度Img · Γ1的VBi (維生素BI)、終濃度Img · Γ1的VB2 (維生素B2)，用水補足體積；所述第一代繼代培養基為在液體MS培養基中添加具有如下終濃度的各組分終濃度為lmg/L的2，4-D、終濃度為O. 2mg/L的6-BA、終濃度為O. 2mg/L的ABA (脫落酸)、終濃度為40g · L—1的蔗糖、終濃度為9. Og · L—1的瓊脂、終濃度為O. 5g · L—1的水解酪蛋白、終濃度為Img · Γ1的VB1和終濃度為Img · Γ1的VB2，用水補足體積；所述第二代繼代培養基為將所述第一次繼代培養基中的蔗糖終濃度調整為35g · L_\瓊脂終濃度調整為8. Og · L—1，其他成分和濃度不變，用水補足體積；所述第三代繼代培養基為將所述第二次繼代培養基中的蔗糖終濃度調整為30g · L_\瓊脂終濃度調整為7. Og · L—1，其他成分和濃度不變，用水補足體積。上述方法中，所述誘導培養的條件為溫度24_26°C、光照強度1000-3000umolm_2s_1下暗培養I個月；所述第一次、第二次、第三次繼代培養條件均為溫度24_26°C、黑暗培養20天。上述方法中，在所述第一次繼代培養后和所述第二次繼代培養前還包括如下步驟選取第一次繼代愈傷組織中的胚性愈傷組織；所述選取第一次繼代愈傷組織中的胚性愈傷組織具體為剝離松軟第一次繼代愈傷組織，而選取質地變硬的第一次繼代愈傷組織。上述方法中，所述結縷草種子為去穎后的結縷草種子。在上述方法中，也可以在第二次、第三次繼代培養時均選用胚性愈傷組織作為培養材料。本專利技術的另一個目的是提供一種制備結縷草再生植株的方法。本專利技術提供的方法，包括如下步驟在上述創制結縷草再生愈傷組織系的方本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種創制結縷草再生愈傷組織系的方法，包括如下步驟：將單粒結縷草種子依次經誘導培養、第一次繼代培養、第二次繼代培養、第三次繼代培養，得到結縷草再生愈傷組織系。

【技術特征摘要】
1.一種創制結縷草再生愈傷組織系的方法，包括如下步驟將單粒結縷草種子依次經誘導培養、第一次繼代培養、第二次繼代培養、第三次繼代培養，得到結縷草再生愈傷組織系O2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于 所述誘導培養、所述第一次繼代培養、所述第二次繼代培養和所述第三次繼代培養采用的培養材料均源自同一個種子； 所述誘導培養為將所述結縷草種子在誘導培養基中誘導培養，得到誘導愈傷組織； 所述第一次繼代培養為將所述誘導愈傷組織在第一代繼代培養基中第一代繼代培養，得到第一次愈傷組織； 所述第二次繼代培養為將所述第一次愈傷組織在第二代繼代培養基中第二代繼代培養，得到第二次愈傷組織； 所述第三次繼代培養為將所述第三次愈傷組織在第三代繼代培養基中第三代繼代培養，得到再生愈傷組織系； 所述誘導培養基為在液體MS培養基中添加具有如下終濃度的各組分終濃度2mg/L的2，4-D、終濃度的O. 15mg/L 6-BA、終濃度30g · Γ1的蔗糖、終濃度7. Og · Γ1的瓊脂、終濃度O.5g · Γ1的水解酪蛋白、終濃度Img · Γ1的VB1、終濃度Img · Γ1的VB2，用水補足體積；所述第一代繼代培養基為在液體MS培養基中添加具有如下終濃度的各組分終濃度為lmg/L的2，4-D、終濃度為O. 2mg/L的6-BA、終濃度為O. 2mg/L的ΑΒΑ、終濃度為40g -Γ1的蔗糖、終濃度為9. Og · Γ1的瓊脂、終濃度為O. 5g · Γ1的水解酪蛋白、終濃度為Img · Γ1的VB1和終濃度為Img · L—1的VB2，用水補足體積； 所述第二代繼代培養基為將所述第一次繼代培養基中的蔗糖終濃度調整為35g · L—1、瓊脂終濃度調整為8. Og · L—1，其他成分和濃度不變，用水補足體積； 所述第三代繼代培養基為將所述第二次繼代培養基中的蔗糖終濃度調整為30g · L'瓊脂終濃度調整為7. Og · L—1，其他成分和濃度不變，用水補足體積。3.根據權利要求I或2所述的方法，其特征在于 所述誘導培養的條件為溫度24-26°C、光照強度1000-3000Umol JiT2iT1下暗培養I個月； 所述第一次、第二次、第三次繼代培養條件均為溫度24-26°C、黑暗培養20天。4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于 在所述第一次繼代培養后和所述第二次繼代培養前還包括如下步驟選取第一次繼代愈傷組織中的胚性愈傷組織。5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述結縷草種子為去穎后的結縷草種子。6.一種制備結縷草再生植株的方法，包括如下步驟在權利要求1-5任一項中的方法中的第三次繼代培養后，將所述結縷草再生愈傷組織系依次經分化培養和生根培養，得到結縷草再生植株； 所述分化培養為將所述結縷草再生愈傷組織系在分化培養基中進行分化培養，得到生芽愈傷組織； 所述分化培養基為在液體MS培養基中添加具有如下終濃度的各組分終濃度為l.Omg/L 6-BA、終濃度為0. 2mg/L KT、終濃度為0. 5mg/L ZT、終濃度為30g · L—1蔗糖、終濃度為7. Og · Γ1瓊脂、終濃度為O. 5g · Γ1水解酪蛋白，終濃度為Img · L4VB1、終濃度為Img · L4VB2,用...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李瑞芬，張杰偉，魏建華，王宏芝，孫振元，
申請(專利權)人：北京農業生物技術研究中心，
類型：發明
國別省市：